魔芋精粉中葡甘聚糖含量的測定

李 浪，李茂纖，葉 坪，張澤俊，李俊杰，龔健康

(昭通學院 化學化工學院,云南 昭通 657000)

魔芋，其學名為蒟蒻(學名Amorphophallus konjac，簡稱Konjac)，又名磨芋、花梗蓮、蛇六谷、鬼芋等，中國古代又稱妖芋，為天南星科植物[1]。我國魔芋資源屬于比較豐富的國家之一，有2000多年的栽培歷史，最早栽種是在我國的西南地區，我國目前栽種品種共有21種，它們主要是分布在福建、臺灣、陜西、四川、湖北、安徽、浙江、云南等地，主要種植有兩個品種白魔芋和花魔芋[2]。目前全球魔芋栽種主要集中分布在印度尼西亞、緬甸、中國、越南、日本等國。魔芋多生長于疏林下、林緣以及溪谷兩旁濕潤地，多生長于海拔310m至2200m 的地區。根據中國魔芋區劃分區[3]，云南魔芋最適宜種植區是昭通市，它擁有全國優質金江白魔芋(葡甘聚糖含量高達74.04%遠遠高于國家一級>68%的標準)原產地和主產區[4-6]，金沙白魔芋是全國魔芋最優良的品種具有很大的研究價值。目前由昭通生產的魔芋精粉銷往國內、日本和越南等地。

魔芋是一種傳統食品，具有低熱量、低脂肪和高纖維的優良食品。魔芋中的膳食纖維對人體營養平衡調節有重要作用。在醫藥典籍《本草綱目》、《開寶本草》等書中記載魔芋具有抗癌、利尿、解毒消腫、健胃、養發等功效[7]，其性味辛寒。除此之外，因為魔芋具備良好的流變性、凝膠性、水溶性、增稠性、高黏性等，目前已經逐漸應用在食品保鮮、日用化工、工廠工業、醫藥、等領域，魔芋現在已經成為一種優質的膳食纖維源和功能性原料。魔芋塊莖中含有的營養成分主要有葡甘露聚糖、淀粉、纖維、蛋白質，其中主要葡甘露聚糖是效成分，由D-葡萄糖和D-甘露糖通過β-1，4糖苷鍵合的高分子多糖。葡甘露聚糖由于具有營養價值高，不提供熱能的特點，所以其具有調節膽固醇代謝的功能、減肥、便秘、糖尿病、對動脈硬化、膽結石、肥胖癥等有顯著療效，被稱健康食品。測定魔芋中葡甘聚糖的含量有重要的意義[8]，葡甘露聚糖含量的測定方法主要有3,5-二硝基水楊酸比色法、氣相色譜法費林滴定法、苯酚比色法等[9]，其中費林滴定法是經典的國標法，但操作太繁雜；苯酚比色法測定中試劑不穩定，并且苯酚毒性較大；氣相色譜法測定需要使用氣相色譜儀，導致使用受到限制。而3，5-二硝基水楊酸比色法操作較簡便，測定成本低，所以此測定方法是魔芋葡甘露聚糖測定中理想的方法。本論文采用3，5-二硝基水楊酸法測定本土魔芋精粉中葡苷聚糖的含量，為魔芋精粉的品質控制提供依據。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

儀器：800型離心沉淀器(上海手術器械廠)，磁力攪拌器(國華88-1)，恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，電子天平(上海良平)，7200可見光分光光度計(上海菁華)，比色皿，250mL容量瓶，25mL容量瓶，10mL容量瓶，試管，玻璃棒，燒杯，移液管。

藥品：天津市風船化學試劑科技有限公司生產的氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉，3，5-二硝基水楊酸(廣東光華科技股份有限公司)，昭通魔芋精粉，甲酸，鹽酸，葡萄糖標準品。3，5-二硝基水楊酸(DNS)配制： 用電子天平準確稱取3，5-二硝基水楊酸1.0057g，加入20mL 2.0mol/L-1NaOH，在稱取酒石酸鉀鈉30.0989g充分攪拌溶解，用蒸餾水定容至100mL。放置兩天，用漏斗過濾，保存在棕色試劑瓶中備用。甲酸-氫氧化鈉緩沖液配制：移取1mL甲酸放入燒杯中加入60mL蒸餾水，用電子天平準確稱取0.25g氫氧化鈉加入燒杯，攪拌溶解倒入250mL容量瓶中加蒸餾水定容至刻度線。1mg/mL葡萄糖標準溶液配制：用電子天平稱取分析葡萄糖0.1004g放入燒杯加蒸餾水攪拌溶解，倒入容量瓶，定容至100mL。

1.2 實驗方法和結果

1.2.1 葡萄糖標準曲線制作

1.2.1.1 最大吸收波長測定

取葡萄糖標準液用分光光度計在480～550nm之間掃描，葡萄糖標準溶液在490nm處有最大吸收波長，所以確定其最大波長為490nm。

1.2.1.2 葡萄糖標準曲線繪制

用移液管分別準確移取葡萄糖標準溶液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2mL分別置于10mL的容量瓶中，加蒸餾水補足3mL。取3mL蒸餾水做空白對照組，在6個容量瓶中分別準確加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑并搖勻。置于提前加熱好的恒溫水浴鍋中，加熱5min。取出至于試管架上冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10mL搖勻。

在490nm處測定吸光度值，以標準葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。線性回歸方程為：y=7.31x+0.0666 ，R2=0.9995，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.2.2 魔芋葡甘聚糖提取液制備、提取和測定

準確稱取3份昭通魔芋精粉約0.2g，放入100mL燒杯中并加入50mL甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液。在磁力攪拌器上勻速攪拌2小時以上，并靜置溶脹過夜。倒入100mL容量瓶并用配制好的甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液定容至刻度線，搖勻。在離心機上以4000 r/min的轉速離心20分鐘使其溶液分層。上清液就為魔芋精粉中葡苷聚糖提取液。

用移液管準確移取上述魔芋葡甘聚糖提取液5.00mL，加入到25mL容量瓶中。在準確移取3 mol/L的硫酸2.50mL加入，搖勻。放置于恒溫水浴鍋中加熱水解1.5h。用冷卻水冷卻到室溫。加入2.5mL 6mol/L的氫氧化鈉溶液搖勻后再加入蒸餾水定容至刻度線。

分別移取上述制得的魔芋精粉葡苷聚糖水解液和蒸餾水(作為空白對照)2.5mL放置于試管中，加入3，5-二硝基水楊酸顯色劑(DNS)，在恒溫水浴鍋中水浴5min。自然冷卻后倒入到25mL容量瓶中加蒸餾水定容至刻度線，測定其吸光度。

2 結果分析

2.1 魔芋葡甘聚糖提取條件的優化

2.1.1 水解時間對魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

取上述待測液2.5mL，分別水解0.5，1，1.5，2，2.5h 5個梯度下，按上述2.2.2實驗方法在最大波長處測其吸光度。實驗結果如表1所示。實驗結果表明其最佳水解時間在1.5h。

表1 水解時間對魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.1.2 鹽酸加入量對魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

取上述待測液2.5mL，選取1，1.5，2，2.5，3mL 5個梯度鹽酸加入量，按上述2.2.2方法測吸光度。實驗結果如表2所示，實驗結果表明鹽酸最佳加入量為1mL。

表2 鹽酸加入量對魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.1.3 氫氧化鈉加入量對魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

分別選取0.5，0.75，1，1.25，1.5mL 5個梯度作為氫氧化鈉加入量。按上述2.2.2方法測吸光度。實驗結果如表3所示，實驗結果表明氫氧化鈉最佳加入量為0.5mL。

表3 氫氧化鈉加入量對魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.1.4 共沸時間對魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

分別共沸3,5,7,9min和11min 5個梯度下，按上述2.2.2方法測吸光度。實驗結果如表4所示，實驗結果表明其共沸最佳時間為5min。

表4 共沸時間對魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.2 穩定性及重復性實驗

移取上述2.2.2制備的溶液，每隔30min測其吸光度，連續測定5h考察其穩定性，實驗結果表明5h內顯色穩定，吸光度無明顯變化。

分別稱取5份0.2 g的魔芋精粉，按其2.2.2步驟做三組重復性實驗進一步確定實驗的可行性。實驗結果表明RSD為0.0377%，小于5%，該方法重現性較好,該方法可行。

2.4 精密度實驗

移取2.5mL水解溶液，用按其2.2.2步驟進行含量測定，重復進樣6次，計算RSD值為0.0023%，說明精密度良好。

2.5 回收率實驗

準確吸取2.5mL水解試液2份，一份按其2.2.2步驟進行含量測定，一份加入葡萄糖標準使用液0.1mL(相當于0.1mg)，按相同的方法進行溶液的制備，測定吸光度，計算回收率得95.52% 。

2.6 魔芋精粉中葡甘聚糖含量

步驟2.2.2中測定的吸光度值如表5所示，根據線性回歸方程式計算出魔芋中葡甘聚糖的濃度。再根據下式葡甘聚糖的含量的計算公式算出魔芋中葡甘聚糖的含量，其中ε為0.9，是葡甘聚糖中葡萄糖和甘露糖殘基分子量與其水解后生成的葡萄糖和甘露糖分子量之比[10]，為多糖的校正系數，T樣為葡甘聚糖水解液分光光度法測定查標準回歸曲線濃度；m為樣品的重量。通過計算得知魔芋葡甘聚糖含量為83%。

表5 魔芋葡甘聚糖含量的測定結果

3 結論

本論文采用3，5-二硝基水楊酸法測定魔芋精粉中葡苷聚糖的含量，得知含量在83%。在測定中，魔芋中除魔芋葡苷聚糖外還存在半纖維素、少量游離還原糖及淀粉纖維素等。在劇烈攪拌下魔芋葡甘聚糖可形成穩定的膠體溶液。天然半纖維素和淀粉纖維素由于不溶于水，因此可以通過沉淀離心將半纖維素和淀粉纖維素分離出去，從而達到提高測定的準確性。由于魔芋的膨脹系數很大，導致魔芋精粉中葡甘聚糖顆粒容易吸水而溶脹，使提取多糖的時候試劑用量變大，所以取樣的時候要盡量少取一點,一般在1g左右。實驗過程中用100mL的緩沖溶液定容后需要放置過夜，離心取上清液液再進行酸水解從而提高效率。本實驗采用以鹽酸水解方法提取魔芋中葡甘露聚糖,方法簡單， 耗費試劑量少，產率高，工藝比較簡單