刺玫紅色素微波輔助提取及其抗氧化性研究

張晨萍，趙志剛，宿 婧，伊文博，趙 悅

(忻州師范學院 生物系，山西 忻州 034000)

現代人對健康食品和食品安全的要求越來越高，天然色素直接取自于自然界中的動物、植物和微生物，不僅具有良好色澤，而且具有一定的營養價值和保健功效，用于食品、化妝品乃至藥品安全可靠[1]。刺玫花(Rose rugosa)，薔薇科薔薇屬植物，多年生常綠或落葉小灌木[2]。刺玫紅色素屬于水溶性色素，易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑。有研究表明，品種不同、溶液pH值不同，刺玫紅色素的顏色也不同，最大吸收波長也不同，一般在可見光區500～530nm有吸收。刺玫色素屬于花色苷色素，具有抗氧化和調節血脂作用，同時具有抑菌作用，對金黃色葡萄球菌、銅鋁假單胞菌、白色念珠球菌等菌種作用最為明顯[3]。刺玫色素對羊毛和蠶絲織物染色效果較好，可作為蛋白質纖維染色劑[4]。本實驗以刺玫花瓣為原料，采用微波輔助提取刺玫紅色素，并研究其體外抗氧化性，為刺玫的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

新鮮刺玫，山西忻州，取花瓣于40℃烘干后粉碎；矢車菊-3，5-O-雙葡萄糖苷(Cy-3,5-diglu)標準品，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇：鄭州派尼化學試劑廠，分析純。

1.2 主要儀器

752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；LC-4016低速離心機：安徽中佳科學儀器有限公司；UV-2800 型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯公司；NJLO7-3型實驗專用微波爐：南京杰全微波設備有限公司；FA2004N電子天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 刺玫紅色素最大吸收波長

圖1 刺玫紅色素吸收光譜

Fig.1 Absorption spectrum of rose rugosa red pigment

準確稱取0.5g刺玫花瓣粉末，以50%的乙醇為浸提液，料液比(m/V) l∶10，微波功率400W，40℃下提取5min，過濾離心后取上清液定容至100mL，以50%乙醇溶液作為空白，在200～700 nm波長范圍內進行光譜掃描得圖1，由圖可知最大吸收波長為520.2nm。

1.3.2 繪制標準曲線

根據刺玫紅色素的最大吸收波長，選取Cy-3,5-diglu作為參照物，繪制標準曲線[5]。精確稱取Cy-3,5-diglu標準品1.00 mg，溶于50%乙醇溶液中，再稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL一系列濃度梯度，520 nm處測定各自的吸光度，繪制標準曲線，如圖2。

圖2 Cy-3,5-diglu 標準曲線Fig.2 Standard curve of Cy-3,5-diglu

其中，X為刺玫紅色素得率(mg/g)，C為根據標準曲線計算出的濃度(μg/mL),V為定容體積(mL)，M為原料刺玫花質量(g)。

1.3.3 刺玫紅色素的提取方法

1.3.3.1 單因素實驗

稱取0.5g的刺玫花瓣粉末，選擇乙醇體積分數0%、50%、70%、80%、90%、100%，微波功率300W、400W、500W、600W、700W，提取時間2min、3min、4min、5min、6min，液料比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，提取所得溶液于4000r/min離心20min，取上清液，定容至100mL，在520nm處測量吸光度[6]，并計算得率。

1.3.3.2 正交試驗

根據單因素實驗結果，以紅色素得率為參考指標，采用正交表L9(34)優化微波法輔助提取刺玫紅色素的最佳工藝條件，其因子水平見表 1。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Tab.e 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

1.3.4 刺玫花紅色素體外抗氧化性測定

按照上述試驗得出的最佳工藝條件提取刺玫紅色素，得到的提取液濃縮干燥后用體積分數 50 %的乙醇溶液配制為10 mg/mL、20 mg/mL、30mg/mL、40 mg/mL、50mg/mL質量濃度的刺玫花紅色素溶液，并配制同濃度的Vc作對照[7]。

1.3.4.1 總還原力測定

采用鐵離子還原力測定法[8]，取5支試管分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，加入3.0 mL pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL1%的鐵氰化鉀溶液，45℃水浴30 min后放在室溫下自然冷卻后加入3.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，震蕩混合后離心(6000 r/min，20 min)。取上清液3 mL加入2 mL蒸餾水和1 mL0.1%三氯化鐵溶液振蕩搖勻，在700 nm處測吸光度值，以同濃度的Vc作對照。

1.3.4.2 刺玫花紅色素清除羥基自由基(·OH)能力的測定

采用水楊酸法[9]，取5支試管分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，向其加入濃度為6 mmol/L的亞硫酸鐵溶液1 mL，再加入相同濃度的雙氧水1 mL，振蕩搖勻后放置10 min，再加入1 mL6 mmol/L的水楊酸溶液，振蕩搖勻放置30 min，在510 nm處測吸光度值，以同濃度的Vc作陽性對照。

其中：A0——不加樣品的吸光度值；Ai——加入樣品的吸光度值；Aj——不加入水楊酸的吸光度值。

1.3.4.3 刺玫花紅色素清除超氧陰離子自由基(O2-·H)能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[10]，取5支試管分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，加入pH為8.2的Tris-HCl緩沖液6 mL，振蕩搖勻置于37℃水浴鍋中水浴10 min，加入37℃鄰苯三酚鹽酸溶液1 mL，振蕩搖勻靜置4 min后用1 mL濃鹽酸終止反應，在波長325 nm處測定吸光度值。以同濃度的Vc作陽性對照。

其中：A0——不加樣品測定的吸光度值；A——加入樣品測定的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 微波法輔助提取刺玫紅色素工藝條件優化

2.1.1 單因素實驗

從圖2(a)可以看出，紅色素得率伴隨著乙醇體積分數增加而逐步降低，乙醇體積分數為50%時，紅色素得率較高。從經濟方面考慮，50%乙醇作為溶劑也較為合適。

從圖2(b)可以看出，微波法功率在300～500W之間，紅色素得率伴隨著微波功率增加而增加，在微波法功率達到500W的時候，紅色素得率達到了最大值，但是之后隨著微波功率增加得率降低，這可能是因為微波法有很強的熱效應，功率過大可能會使色素受到一定的破壞，引起得率降低[11]。

從圖2(c)可以看出，微波時間達到3min時，色素得率達到了最大值，之后伴隨著微波時間的逐步增加色素得率降低，提取時間過長，色素長期處于較高溫度下，結構會被破壞，得率降低[12]。由此可知微波法提取刺玫紅色素時間不應過長。

從圖2(d)可以看出，溫度在25-50℃之間，色素得率伴隨著溫度的增加逐步增加，溫度大于50℃時，色素得率降低。

從圖2(e)可以看出，液料比在1∶4～1∶8之間，色素得率伴隨著液料比的變化逐步增加，液料比為1∶8～1∶12時，伴隨著液料比的變化色素得率降低。

圖3 單因素實驗

Fig.3 Single factor experiment

2.1.2 正交試驗分析

根據單因素試驗結果與分析，對提取刺玫紅色素的微波功率、提取時間、提取溫度、料液比進行了L9(34)試驗，其結果如表2。由正交試驗可以看出各因素對刺玫紅色素得率的影響順序為C>B>A>D，即提取溫度>微波時間>微波功率>料液比。由正交試驗可得到刺玫紅色素最佳提取的優化工藝參數為：A2B1C3D3，即在微波功率500W，微波時間2min，提取溫度60℃，料液比為1∶10 g/m L。對所得出的正交表進行驗證試驗，用最佳優化的條件進行三次重復試驗，刺玫紅色素得率接近2.03mg/g，結果重現性好。

表2 正交實驗結果Tab.e 2 Result of orthogonal experiment

表2(續)

2.2 刺玫紅色素體外抗氧化活性測定結果

2.2.1 總還原力測定結果

分析圖4可以得出，刺玫紅色素溶液的還原力與Vc溶液的還原力都隨著溶液濃度的增加而增加，說明刺玫紅色素具有一定的抗氧化活性，且與濃度成正比。

圖4 刺玫紅色素還原力Fig.4 Reducing force of rose rugosa red pigment

2.2.2 刺玫紅色素對羥基自由基(·OH)清除率的測定

體系發生化學反應使得在510 nm處測定的吸光度值變小，根據測得的吸光度值可以計算出刺玫紅色素對羥基自由基(·OH)的清除能力。分析圖5可以得出，隨著刺玫紅色素溶液濃度的增加，其吸光度值降低，對羥基自由基的清除率增加，說明刺玫紅色素羥基自由基(·OH)有一定的清除能力，并與濃度呈正比。

圖5 刺玫紅色素對羥基自由基(·OH)清除率Fig.5 Red pigment ability to remove hydroxyl radicals(·OH)

2.2.3 刺玫紅色素對超氧陰離子(O2-·)清除能力測定結果

在堿性條件下鄰苯三酚發生氧化反應，產生有色的產物和超氧陰離子自由基(O2-·H)；超氧陰離子自由基(O2-·H)對此氧化反應有催化作用，加速反應的進行。隨著反應的進行，有色中間產物產生的越多，顏色越深，在325nm處測得的吸光度值越大[13]，其對羥基自由基的清除率越大，根據測得的吸光度值可以判斷刺玫紅色素對超氧陰離子(O2-·H)的清除能力。分析圖6可以得出，刺玫紅色素提取液對超氧陰離子自由基(O2-·H)具有較好的清除能力。

圖6 刺玫紅色素對超氧陰離子自由基清除率Fig.6 Red pigment ability superoxide anion radicals(O2-·H)

3 結論

本研究采用正交試驗對工藝條件進行優化，最后根據刺玫紅色素得率，得出微波提取的最優方案是乙醇濃度50%，微波功率500W，微波時間2min，提取溫度60℃，料液比為1∶10 g/m L，此時花色素得率為2.03mg/g。與傳統水浴提取法和超聲波提取法對比微波提取法大大地提高了色素得率，同時縮短了提取時間。此實驗證明了微波法提取刺玫紅色素的可行性。通過對刺玫紅色素的體外抗氧化性的測定結果可以看出，刺玫紅色素具有一定的體外抗氧化性，且隨著刺玫紅色素溶液濃度的增大，還原力增加，其對羥基自由基(·OH)的清除能力增加，對超氧陰離子自由基(O2-·H)的清除能力也在增加。