云南竹靈芝中的總黃酮的提取研究

費潔羽，楊凌杰，廖晨茜，何麗娜，陳志豪，王石磊

(浙江樹人大學 生物與環境工程學院,浙江 杭州 310015)

黃酮類化合物是一類常見的次生代謝產物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血脂和高血壓、改善血管脆性和通透性、預防冠心病和心絞痛等多種藥理活性，在藥品開發和保健食品開發中具有廣泛的應用價值[1-2]。黃酮大多數與糖結合，以黃酮苷的形式存在，少量以游離態存在。黃酮提取方法主要有溶劑回流提取法、大孔吸附樹脂法、超聲波或微波輔助提取法、超臨界流體提取法、酶解法等[3]。目前關于黃酮的提取已有較多研究，但靈芝中黃酮的提取研究目前仍較少。竹靈芝是一種喜熱靈芝(Ganoderma calidophilum)[4]，生長于云南、海南等地，竹靈芝中黃酮含量的相關研究則更少。超聲波能夠破壞細胞壁并增大溶劑向細胞的滲透量，有利于目標提取成分的溶出，且超聲波的熱效應可使溶劑和原料組織溫度升高，提高目標提取成分的溶出，加快提取。超聲波輔助提取具有提取效率高、提取時間短、適用性廣、操作簡單等優點，在天然產物的提取中應用廣泛[5]。本文主要研究超聲波輔助下的竹靈芝中黃酮的提取。

1 材料與儀器

無水乙醇、NaNO2、NaOH、Al(NO3)3(以上均為分析純試劑)，蘆丁(純度98%，阿拉丁)，竹靈芝(市售，采于云南文山)、容量瓶，電子分析天平，紫外分光光度計(日本島津UV-124型)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的建立

準確稱取于蘆丁標準品100 mg，用50 %乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為1 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別精密吸取蘆丁標準品溶液0 ，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5 % NaNO2溶液，搖勻靜置5 min后再加入1.0 mL 10 % Al(NO3)3溶液，搖勻，放置5 min后加人10 mL 4% NaOH溶液，用50 %乙醇定容。以50 %乙醇為空白對照，在波長510 nm處測定標準樣的吸光度，得到蘆丁質量濃度(mg/mL)與吸光度之間的標準曲線。

2.2 竹靈芝中總黃酮的提取工藝優化

2.2.1 料液比對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取5份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，加入乙醇濃度50 %、料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的乙醇，在60 ℃溫度下超聲提取40 min。過濾上清液，將濾液置于100 mL容量瓶中，用50 %乙醇定容。

將5種提取條件下得到的靈芝濾液分別取1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5 % NaNO2溶液，搖勻靜置5 min后再加入1.0 mL 10 % Al(NO3)3溶液，搖勻，放置5 min后加人10 mL 4 % NaOH溶液，用50 %乙醇定容。以50 %乙醇為空白對照，在波長510 nm處測定標準樣的吸光度，通過標準曲線轉換計算即可。

2.2.2 超聲時間對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取6份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，加入濃度50 %、料液比為1∶40的乙醇，在60 ℃下，分別在提取時間20,30,40,50,60,70 min的條件下超聲提取。后續操作同“2.2.1”所述方法，計算黃酮的提取得率。

2.2.3 乙醇濃度對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取4份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，分別加入料液比1∶40的50%，60%，70%，80%乙醇，在60 ℃下超聲提取50 min。后續操作同“2.2.1”所述方法，計算黃酮的提取得率。

2.2.4 超聲溫度對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取4份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，加入料液比1∶40，濃度70 %的乙醇，分別在40，50，60，70 ℃條件下超聲提取50 min。后續操作同“2.2.1”所述方法，隨后計算各實驗條件下黃酮的提取得率。

2.2.5 正交實驗

根據單因素試驗結果，把料液比、超聲時間、乙醇濃度、超聲溫度為自變量，靈芝黃酮得率為評價指標，根據L9(34)的正交設計表進行優化實驗。篩選出最優提取條件，并利用該方案進行三次提取，驗證方法的穩定性

3 結果和分析

3.1 蘆丁標準曲線

將吸光度對蘆丁溶液的濃度進行線性回歸分析，得回歸方程y = 0.4527x - 0.0007，R2= 0.9998，表明在該范圍內具有良好的線性關系。實驗結果見表1和圖1。

表1 蘆丁濃度與吸光度之間的關系Tab.1 relationship between the concentration of luding and the absorbance

圖1 蘆丁標準曲線

Fig.1 Relationship between rutin concentration and the absorbance

3.2 竹靈芝中總黃酮的提取工藝優化

3.2.1 料液比對靈芝黃酮得率的影響

不同料液比下靈芝黃酮得率如圖2所示，由圖2可知，在料液比低于 1∶40 時，提取用液增加使靈芝黃酮得率也隨之增加，當料液比超過1∶40 后，總黃酮提取得率增加緩慢。

圖2 不同提取條件與靈芝總黃酮得率之間的關系

Fig.2 the extraction yield of total flavonoids under different extraction conditions

3.2.2 超聲時間對靈芝黃酮得率的影響

不同超聲時間下靈芝黃酮得率如圖2所示。實驗表明：超聲時間為50 min時，靈芝中黃酮提取得率最高，為6.086 mg/g；當超聲時間未達到50 min 時，超聲時間越久，靈芝中黃酮的得率越大，可以得出一定時間的超聲波處理有利于靈芝中黃酮類化合物的提取的結論；但當超聲時間超過50 min 后，靈芝中黃酮得率反而降低，但下降的幅度并不太大，這可能是由于超聲時間過長，導致靈芝中黃酮類成分被破壞，從而降低提取得率。

3.2.3 乙醇濃度對靈芝黃酮得率的影響

由圖2可知，當乙醇濃度小于70 %時，隨著乙醇濃度的增加會使靈芝中黃酮的得率也隨之上升，當乙醇濃度大于70 %時，黃酮類化合物的得率隨著乙醇濃度的增加而呈現下降的趨勢。原因可能是因為乙醇濃度不同，其極性也不相同，而黃酮類化合物有很大的極性范圍，可以推斷出當乙醇濃度為70 %時，它的極性可能與靈芝中黃酮類化合物的極性最為相似，所以在70 %的乙醇濃度下是最適合竹靈芝中黃酮的提取條件。

3.2.4 超聲溫度對靈芝黃酮得率的影響

實驗表明：提取率隨著超聲溫度的提高而提高，達到60 ℃最大。可能是由于隨著超聲波的溫度升高，分子運動才變得更加激烈，從而加快了靈芝中黃酮成分的擴散，促進了有效成分在試劑中的溶出，有利于黃酮類化合物的浸出。

3.2.5 正交實驗

選擇了料液比(A)、超聲時間(B)、乙醇濃度(C)、超聲溫度(D)四個因素進行單因素實驗，初步確定各因素的較優條件，再采用L9(34)正交表進行正交實驗，進一步優化提取工藝。通過正交實驗研究了各因素對提取率的影響，確定了各影響因素的先后順序為A>C>D>B，即料液比的影響最明顯，其次是乙醇濃度，然后是超聲溫度，最后是超聲時間。通過正交實驗確定超聲波法提取靈芝中黃酮含量的最佳工藝條件為A3B3C2D1，即最優的提取條件為料液比1∶50，超聲時間60 min，乙醇濃度70 %，超聲溫度50 ℃。

表2 試驗因素水平Tab.2 Factor level of orthogonal experiment

表3 正交試驗設計表及結果Tab.3 Orthogonal experiment chart and result

3.3 驗證實驗

根據上述實驗，利用正交試驗得出的最佳提取條件對靈芝中的黃酮進行提取，平行進行三次實驗，三次實驗的得率結果分別為:7.275，7.268，7.264，平均值為7.269 mg/g。從三次測定的靈芝黃酮得率可以看出，正交設計的得出的最佳提取方案，提取率較高，且具有較好的重現性和穩定性。

4 結論

(1)以蘆丁為標準物質，在濃度0～1.0 mg/mL范圍內反應物與吸光度之間的線性關系較好。

(2)從竹靈芝中提取總黃酮時，總黃酮的得率隨著提取溶劑的增加，逐漸增加，當提取溶劑超過40倍時，隨著提取溶劑的增加，黃酮得率的增加很緩慢；黃酮得率隨著超聲時間的增加先升高再降低，在50 min時有最高提取得率；乙醇濃度增加，黃酮提取得率先增加后減少，在70%乙醇濃度時有最高的提取得率；隨著超聲時間的增加，黃酮得率逐漸提高，到60min后，黃酮得率增加不再明顯甚至有所下降。

(3)通過正交試驗，發現利用乙醇溶液對靈芝中的黃酮進行提取時，各因素對實驗結果的影響順序依次為料液比>乙醇濃度>超聲溫度>超聲時間，最優的提取條件為料液比1∶50，超聲時間60 min，乙醇濃度70 %，超聲溫度50 ℃，在該條件下對靈芝中的黃酮進行提取有最高的提取得率，提取得率約為每1g竹靈芝中可提取得7.27mg的總黃酮。