轉基因玉米MON89034、MON810、MIR162雙重數字PCR定量方法的建立

梁文 楊鎮州 李妍 羅超 聞艷麗 劉剛

摘要：針對進出口貿易中涉及較多的轉基因玉米MON89034、MON810、MIR162品系，研究一套雙重數字PCR（dPCR）定量檢測方法，包括引物探針的序列設計和濃度，DNA模板濃度，PCR反應過程的時間、溫度等。該方法的定量限為0.1%，轉基因定量檢測范圍覆蓋0.1%～100%，線性系數為0.999，精密度優于10%。該檢測方法中，每個微反應體系都含有兩套引物探針，分別用FAM和VIC熒光通道進行檢測，能實現內外源基因的同時檢測，避免同一樣品因取樣不一致造成的定量差異。該方法可以同時應用到市面上最常用微滴dPCR平臺和3D芯片dPCR平臺，且兩種方法定量結果一致性好。

關鍵詞：生物技術;數字PCR;雙重數字PCR;轉基因玉米

中圖分類號：0503 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）06-0070-07

收稿日期：2019-01-02;收到修改稿日期：2019-03-18

基金項目：國家科技重大專項項目（2018ZX0801112B）;國家自然科學面上基金項目（21775104）;上海市質量技術監督局科研項目（2017-03）

作者簡介：梁文（1986-），女，四川德陽市人，工程師，碩士，主要從事轉基因檢測方法研究、核酸定量方法研究。

通信作者：劉剛（1982-），男，山東青島市人，教授級高工，博士，主要從事核酸檢測方法研究。

0 引言

隨著生物技術產業的迅速發展，全球轉基因作物的研發速度和面積持續增加，轉基因的食品安全問題也成為世界關注的熱點[1]。控制轉基因的含量，實施轉基因食品標識制度是各國加強轉基因管理的重要舉措。轉基因檢測方法分核酸檢測和蛋白檢測兩類。核酸在生物細胞中含量相對穩定，在產品加工中也相對不容易被破壞，而且核酸檢測方法靈敏度高、操作簡便，因此成為轉基因檢測的主流方法[2]。常用的核酸檢測手段包括等溫擴增、普通PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR（real-timefluoresence quantitative，qPCR）、數字PCR（dPCR）等方法[3]。目前常用的qPCR法可以篩選轉基因特異DNA片段，但大多數的qPCR在轉基因檢測方法的應用還停留在定性階段[4]。

dPCR作為一種新的PCR技術在各檢測領域發展迅猛，尤其在轉基因定量檢測方面有獨特優勢。dPCR的技術特點是，不需要建立工作曲線，避免了標準品配制過程及標準品與待測樣品的天然差異導致的偏差[5]。dPCR采用終點熒光檢測，微小反應單元的獨立擴增不易受到轉基因樣品DNA提取過程中抑制物的影響[6]。dPCR定量準確度高，對于痕量轉基因DNA樣品檢測重復性好[7]。在dPCR檢測體系中設計雙重熒光檢測，分別用于標記外源基因和內源基因，可以實現內外源基因的雙重檢測，進一步避免加樣誤差的同時降低了檢測成本，提高了檢測效率。

本文在轉基因玉米品系MON89034，MON810，MIR162定量檢測體系中實現了內源基因和外源基因的同時檢測，通過一個反應直接得出外源基因和內源基因的拷貝數，進而給出外源基因和內源基因的拷貝數濃度的比，即轉基因的含量[8]。目前，市面上的dPCR分為微滴PCR和芯片PCR兩大類。兩者在獨立的PCR反應微小單元形成方式，加熱介質方面各有不同。本文首先在芯片dPCR平臺上建立了實驗方法，考察其特異性、定量限和線性范圍、精密度。最后將該方法應用到微滴dPCR中，考察了兩種平臺的結果一致性。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（天根DP305，北京）;引物及探針（佰力格，上海）;3D數字PCR系統（QuantStudio^TM3D，ABI公司）;微滴數字PCR（QX200，伯樂公司）;核酸定量儀（Nanodrop2000，thermo公司）。

轉基因標準物質：轉基因玉米種子粉末MON810（ERM-BF413gk），轉基因玉米種子粉末MON89034（AOCS 0906-E），轉基因玉米種子粉末MIR162（AOCS1208-A），種子粉末均為F1代雜合子。

1.2 轉基因DNA的抽提

用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒進行玉米基因組DNA的抽提。在抽提過程中需要用到酚氯仿，以有效去除玉米材料中的多糖和多酚成分。抽提結束后用核酸定量儀定量DNA的濃度，要求其A260/A280在1.8～2.0之間。

1.3 DNA模板濃度的控制

dPCR法的模板DNA濃度受到泊松分布原理的限制，即大量微反應單元（10000以上）中，DNA模板的分布應具備隨機性。由于目前市售dPCR的微反應單元數量都至少高于10000個，在保證定量結果的重復性優于25%的條件下，要滿足定量限達到0.1%，則模板DNA濃度應保證上樣體系中總DNA模板數（內源基因拷貝數）在4700～73551拷貝范圍內[9]。從而避免低轉基因含量樣本出現轉基因片段漏取樣的情況，也避免DNA拷貝數過高，陽性過載使數據精確度下降的情況。

1.4 反應體系和反應條件

3種玉米品系的內源基因均采用Adh-1基因為檢測靶基因，外源基因選擇每個玉米品系的特異性序列[10-11]，引物探針的序列見表1。以轉基因樣品MON89034為例，用實時熒光PCR反應檢驗設計引物探針的特異性。在含轉基因MON89034外源基因的引物探針或內源基因Adh-1引物探針的PCR反應體系中，分別加入轉基因玉米MIR162品系、MON810品系、玉米GA21品系、玉米TC1507品系、玉米T25品系、玉米NK603品系、轉基因玉米MON89034品系和非轉基因玉米的基因組DNA，驗證該引物探針體系是否只針對MON89034基因組有品系特異性外源基因擴增曲線，其他樣品僅有內源基因擴增。每個轉基因玉米品系的芯片dPCR反應體系（總體積為20μL）中，內外源基因的正反向引物終濃度均為500nmol/L，探針終濃度為100nmol/L。Master mix體積為10μL，H₂O體積為3.2μL。3D芯片dPCR的反應條件為酶激活和預變性階段：96℃，10min;循環擴增階段：60℃/2min，98℃/30s，共40個循環。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s。

1.5 定量限和線性范圍驗證

定量檢測低限是指被檢測的樣品在合適的精度水平下（一般轉基因定量檢測要求RSD小于25%），能被檢測出的最低含量或濃度[12]。本文將轉基因含量為100%的轉基因玉米品系MON89034與陰性的玉米種子粉末進行混合，制成10%、5%、1%、0.5%、0.1%的樣品，驗證其轉基因含量檢測的定量限和線性范圍。

1.6 精密度實驗

dPCR的實驗結果是通過統計上萬個微小反應單元的結果得出，重復性好。精密度實驗方案為在相同的PCR反應體系中分別加入相同的基因組DNA樣品（選擇了1%、10%、100%轉基因含量的3種樣品），實驗重復8次，統計8次檢測結果的RSD。

1.7 玉米品系混合樣品檢測

采用雙盲樣驗證法，由實驗室不同人員利用1.1中轉基因玉米種子粉標準物質按照質量配比配制成玉米品系混合樣品，然后按照1.2中的方法提取斟建且DNA。盲樣1為含25%玉米MIR162和50%玉米MON89034混合樣品，盲樣2為含50%玉米MIR162和4%玉米MON810混合樣品，分別由轉基因玉米MIR162，MON89034和MON810的擴增體系對混合DNA樣品進行擴增，驗證3個不同玉米品系數字PCR方法定量檢測混合樣本的準確性。

1.8 微滴dPCR和芯片dPCR結果的一致性驗證

將1.1中轉基因玉米種子粉標準物質寄送給兩家不同公司，進行DNA提取實驗和dPCR實驗。在微滴dPCR與芯片dPCR實驗中采用相同的PCR反應體系（相同的引物探針濃度，但PCR預混液Master mix不同，與儀器配套使用），選擇與平臺相適應的PCR反應程序進行實驗，每種平臺實驗重復8次，用T-test比較兩種方法的實驗結果，判斷是否具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 反應條件的建立

本文中所設計的引物探針僅對特定玉米品系有明顯的擴增曲線，對非目標玉米品系無擴增。在芯片dPCR中，所有玉米品系都同時進行外源基因和玉米內源基因的擴增。為了避免可能出現的兩個靶基因的擴增體系相互干擾，本文設計了多個內源基因和外源基因的引物探針進行配對，選出內外源基因都能正常擴增且兩種熒光信號彼此不干擾的擴增體系。每種轉基因玉米的擴增圖見圖1。研究結果表明，3個轉基因玉米品系的內外源基因可以在同一反應體系中進行，且陰性反應孔和陽性反應孔的熒光信號能明顯區分。

2.2 線性范圍和定量限檢測結果

將轉基因含量為100%的轉基因玉米品系MON89034與陰性的玉米進行混合，制成10%、5%，1%、0.5%、0.1%的種子粉末樣品。提取樣品的基因組DNA并進行dPCR的擴增。每個樣品進行3次重復檢測，取3次檢測的平均值作為定值結果。擴增結果顯示，本方法檢測0.1%轉基因含量的種子樣品時RSD為12.5%。本方法檢測轉基因含量0.1%及以上的樣品RSD小于25%，即本方法定量限可達到0.1%。檢測轉基因含量標準值為0.1%～100%的種子樣品，檢測結果方程為Y=1.042X-0-002，其中X為轉基因含量標準值，Y為轉基因含量實際檢測值，線性r²為0.999。具體檢測結果見表2。

2.3 方法精密度檢測

用轉基因含量為100%、10%、1%的轉基因玉米MON89034基因組DNA測試方法的精密度，重復測量8次，檢測結果精密度見表3。不同轉基因比例的精密度均優于10%，符合國際上轉基因定量結果RSD優于25%的要求。

2.4 混合種子粉末樣品檢測結果

在盲樣檢測中，25%玉米MIR162混合樣品的定量結果為19.6%，50%玉米MON89034混合樣品的定量結果為66.7%，50%玉米MIR162混合樣品的定量結果為64.7%，4%玉米MON810混合樣品的定量結果為3_3%，定量結果的誤差均小于25%，符合國家轉基因定量檢測的需要。

2.5 兩種平臺實驗結果的一致性驗證

dPCR主要有微滴式和芯片式兩種平臺，微小反應單元的形成方式有差異。微滴dPCR中微滴在PCR反應前由微滴振蕩器現場生成，芯片dPCR的微孔大小在制造芯片時已經確定。微滴dPCR是在油包水的液體中進行反應，加熱速度快，PCR反應中的退火溫度、時間和芯片式dPCR有所區別。芯片dPCR由于芯片的影響，熱傳導時間較慢，因此芯片dPCR中60℃退火延伸的時間較長，需要2min。而微滴PCR在油包水的液體條件下擴增，退火溫度在56℃反而能到達更好的擴增效果，擴增時間為1min，圖2為微滴PCR退火溫度的優化情況，MON89034品系特異基因擴增優化情況見圖A，圖B。圖A陰性（黑色）信號值在5000～6500之間，陽性（藍色）信號在6000～10000之間，陰性和陽性信號不能明顯區分。圖B優化退火溫度后，陰性信號在1000～2000之間，而陽性信號在6000～8000之間，阻性和陽性信號分離情況好。內源基因Adh-1的擴增情況見圖C、D。圖C和圖D中陰性孔的熒光值（黑色）沒有變化，陽性孔的熒光信號值（藍色）在優化后由3000提高到3500～4000，最終陰性和陽性反應孔的熒光值分離情況更好。微滴dPCR的反應條件為：酶激活和預變性階段：95℃，10min;循環擴增階段：56℃/1min，94℃/30s，共40個循環。

將3種轉基因玉米粉末交給兩家不同公司進行玉米基因組DNA的提取和dPCR檢測實驗。3種轉基因玉米品系在兩種平臺的檢測結果見表4。盡管由于提取DNA濃度不同，兩種平臺的拷貝數濃度有差異，但其轉基因含量定量結果的一致性很好。轉基因含量100%的轉基因玉米MON89034，芯片dPCR和微滴dPCR的定量結果分別為105.6%和106.5%，將兩種檢測方法的結果進行T一檢驗，其顯著性差異P=0.58>0.05，證明兩種方法的檢測結果沒有顯著性差異。轉基因含量為10%的轉基因玉米MON810，芯片dPCR和微滴dPCR的定量結果分別為9.7%和9.5%，顯著性差異P=0.38>0.05。轉基因含量100%的轉基因玉米MIR162，芯片dPCR和微滴dPCR的定量結果分別為114.2%和115.8%，顯著性差異P=0.39>0.05。3種轉基因玉米用兩種不同平臺檢測結果的T-檢驗表明，兩種平臺的檢測結果沒有顯著性差異。

3 結束語

dPCR定量檢測轉基因產品的靈敏度高，特異性好，可以應用于更多不同轉基因植物品系的定量檢測。本文針對進出口貿易中涉及最多的3個轉基因玉米品系MON89034，MON810，MIR162設計引物探針進行dPCR定量檢測。通過對不同玉米品系的qPCR實驗，驗證了用于3個玉米品系檢測的引物與探針的特異性。在qPCR實驗中具有特異性的內外源基因的引物探針有多種，但能應用在dPCR同一個反應微小單元中，并且內外源基因的擴增體系不相互干擾卻并不容易，很常見的現象是內源或外源基因的擴增受到抑制，從而陰性反應孔和陽性反應孔的熒光信號無法區分，因此不能將qPCR中的反應條件直接應用到dPCR中。本文通過多對引物探針組合，并篩選最佳引物探針濃度、退火溫度、PCR反應過程的時間、溫度等，從而建立一套完整的轉基因玉米dPCR定量檢測方法。該檢測方法中，每個微反應體系都含有兩套引物探針，分別用FAM和VIC熒光通道進行檢測，能實現內外源基因的同時檢測，避免了同一樣品因取樣不一致造成的定量差異，從而節約了檢測成本。該方法可以同時應用到市面上最常用微滴dPCR平臺和3D芯片dPCR平臺。兩種平臺的加熱介質有很大的差異，芯片dPCR是金屬腔室，其微小反應單位的體積變動較小，但熱傳導性略慢，因此退火延伸需要的時間較長，和 qPCR實驗有很大的差異。而微滴dPCR是油包水的液滴，其反應的程序和qPCR實驗基本一致，這樣也利于用qPCR實驗進行PCR反應程序優化。但優化實驗條件后兩種平臺的結果一致性很好，T-test中3種轉基因玉米品系的轉基因含量平均值和重復性RSD沒有顯著性差異。該方法的定量限為0.1%，轉基因定量檢測范圍覆蓋0.1%～100%，線性系數為0.999，精密度優于10%。該方法快速高效，在檢測結果的準確度、穩定性優于傳統的qPCRa在實驗操作上，和qPCR相比不需要制作標準曲線，避免購買昂貴的標準物質，也避免了標準物質和檢測樣品之間的PCR擴增效率差異對實驗結果的影響。將該方法用于轉基因玉米的定量檢測，能為規范我國轉基因監管工作提供技術支撐。

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（編輯：莫婕）