基于ATR-FTIR和1H NMR研究高溫對(duì)牡丹籽油品質(zhì)特性的影響

李秀麗 戢小梅 陳志偉 陳 鎮(zhèn) 戴志剛 陳法志 翟敬華

(武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所1，武漢 430075) (湖北省耕地質(zhì)量與肥料工作總站2，武漢 430070)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Paeoniasect. Moutan DC.)植物，是世界著名花卉，也是中國(guó)十大名花之一，具有較高的觀賞和藥用價(jià)值[1]。近年來(lái)，牡丹的油用價(jià)值也備受關(guān)注[1]。牡丹籽油不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%～92%，尤其是α-亞麻酸(α-linolenic acid, ALA, 18 ∶3)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%～66%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前主要食用油如大豆油(6%～7.95%)和橄欖油(0.73%)等，屬于高檔食用油[2, 3]。然而，油脂的氧化速率與其不飽和度有關(guān)，不飽和度越高越容易被氧化，其中油酸、亞油酸和亞麻酸之間的自氧化速率之比約為1 ∶45 ∶100[4, 5]。油脂的高不飽和度和高亞麻酸含量導(dǎo)致牡丹籽油的氧化穩(wěn)定性極差[6]。此外，牡丹籽油的煙點(diǎn)在240～270 ℃之間，高于其他常用食用油的煙點(diǎn)值，可以用于高溫烹飪，如制作糕點(diǎn)通常需要180～200 ℃加熱1 h。高溫能夠促進(jìn)脂肪酸失去氫原子，產(chǎn)生氧化速率高于自氧化的熱氧化現(xiàn)象[7, 8]。然而，高溫處理對(duì)牡丹籽油品質(zhì)影響方面的研究仍然有待深入。

油脂氧化產(chǎn)生的低分子質(zhì)量異味化合物使油脂的顏色和氣味等感官指標(biāo)發(fā)生改變，誘導(dǎo)脂肪酸化學(xué)結(jié)構(gòu)改變并產(chǎn)生有毒化合物和氧化聚合物[9]。氣相和液相色譜法在油脂檢測(cè)中特異性較差，存在樣品預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)樣測(cè)定等復(fù)雜的環(huán)節(jié)而非常耗時(shí)耗力[10]。值得注意的是，油脂發(fā)生熱氧化后，將導(dǎo)致許多化學(xué)基團(tuán)在中紅外光譜特定波長(zhǎng)下的振動(dòng)峰發(fā)生改變，同時(shí)引起紅外光譜吸光值比值的改變。因此，可借助衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜(attenuated total reflectance-fourier transform infrared spectroscopy, ATR-FTIR)判斷油脂的氧化程度[11]。此外，油脂熱氧化會(huì)造成化學(xué)鍵的斷裂，引起各結(jié)構(gòu)式對(duì)應(yīng)的H化學(xué)位移上各類(lèi)質(zhì)子的相對(duì)含量發(fā)生變化，導(dǎo)致不飽和度降低[10, 12]，依據(jù)1H 核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技術(shù)可以對(duì)熱氧化過(guò)程中各類(lèi)質(zhì)子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行深入分析。本實(shí)驗(yàn)在色譜測(cè)試分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用ATR-FTIR和1H NMR技術(shù)，以化學(xué)基團(tuán)的中紅外光譜特性及各類(lèi)質(zhì)子的相對(duì)含量的變化為切入點(diǎn)，深入研究高溫對(duì)牡丹籽油品質(zhì)特性的影響。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牡丹籽油(國(guó)色坊)為物理壓榨植物油，采購(gòu)后置于低溫、干燥、避光的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩：舜殴舱駥?zhuān)用試劑氘代氯仿(CDCl3)和三甲基硅烷(trimethylsilane, TMS)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YLSB076氣相色譜儀、YLSB012液相色譜儀、VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀、AV400 核磁共振波譜儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 牡丹籽油熱處理

將200 mL牡丹籽油分別放入3個(gè)瓷坩堝中，然后放入恒溫干燥箱中熱處理1 h，共設(shè)置4個(gè)溫度梯度：(25 ± 1)、(100 ± 1)、(150 ± 1)、(200 ± 1) ℃。熱處理過(guò)程中將瓷坩堝的蓋子斜蓋，漏出一個(gè)小口，使牡丹籽油周?chē)鷼怏w的氧含量始終為大氣的含氧量，約21%。熱處理完成后，從干燥箱中取出牡丹籽油，待其冷卻至室溫后倒入棕色廣口瓶中，置于4 ℃環(huán)境中，避光保存。熱處理實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 牡丹籽油理化性質(zhì)的測(cè)定

基于GB 22460—2008測(cè)定色澤；基于GB 5009.229—2016測(cè)定酸值；過(guò)氧化值測(cè)定的測(cè)定參考GB 5009.227—2016；依據(jù)GB 5009.168—2016測(cè)定不同溫度處理?xiàng)l件下牡丹籽油脂肪酸組成；維生素E含量的測(cè)定參考GB 5009.82—2016。本節(jié)實(shí)驗(yàn)均委托農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心進(jìn)行測(cè)定。

2.3 ATR-FTIR表征

在紅外光譜測(cè)定前24 h，取出牡丹籽油樣品并放置于室溫、干燥、避光的環(huán)境備用。紅外光譜測(cè)試在室溫下進(jìn)行，所用儀器為裝有ATR配件的紅外光譜儀，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在每次測(cè)量樣品前，先測(cè)定背景的紅外吸收峰，排除空氣的干擾峰。取0.1 mL牡丹籽油滴于樣品臺(tái)上，選用4 cm-1的分辨率，掃描128次，波數(shù)范圍是600 ～ 4 000 cm-1[11]。每個(gè)處理3次重復(fù)。

2.4 核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)表征

取0.1 mL牡丹籽油置于5 mm的核磁共振樣品管中，再加入0.5 mL的CDCl3，混合均勻后備用。1H NMR的測(cè)試參數(shù)為：溫度：298.0 K；觀察頻率：600.25 MHz；脈沖序列：zg30；氫譜譜寬：12 019.23 Hz；每次自由感應(yīng)衰減掃描次數(shù)：16；虛擬掃描次數(shù)：2；信號(hào)檢測(cè)時(shí)間：2.73 s，恢復(fù)時(shí)間：1 s。化學(xué)位移以TMS(δ=0)為標(biāo)準(zhǔn)校正[10]。

2.5 數(shù)據(jù)擬合及分析

借助Excel2010、SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析，顯著水平為P<0.05，并利用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次的平均值。為了更詳細(xì)地借助FTIR分析熱處理對(duì)牡丹籽油化學(xué)物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的影響，參考Raba等[11]對(duì)咖啡油FTIR圖譜中物質(zhì)變化規(guī)律的研究，對(duì)FTIR圖譜中4種峰值(A)的比值進(jìn)行了探討。包括：RⅠ=A 3 009 cm-1/ A 2 924 cm-1，RⅡ=A 3 009 cm-1/ A 2 855 cm-1，RⅢ=A 3 009 cm-1/ A 1 744 cm-1，RⅣ=A 1 744 cm-1/ A 2 924 cm-1[11]。借助Brucker TopSpin2.1軟件處理NMR圖譜數(shù)據(jù)，根據(jù)質(zhì)子數(shù)與峰面積成正比的特點(diǎn)，對(duì)各類(lèi)質(zhì)子的積分值進(jìn)行歸一化處理，即將各特征峰的峰面積除以總峰面積，計(jì)算出各類(lèi)質(zhì)子的相對(duì)含量[10]。

3 結(jié)果與討論

3.1 牡丹籽油的基本理化性質(zhì)

高溫處理影響著牡丹籽油的基本理化性質(zhì)，包括色澤、穩(wěn)定性、脂肪酸組成和維生素E的含量，結(jié)果詳見(jiàn)表1：隨著加熱溫度的增加，牡丹籽油色澤逐漸加深，如色紅的增加。酸值和氧化程度也呈升高趨勢(shì)，同時(shí)高溫誘導(dǎo)了脂肪酸組成的改變：與未加熱處理相比，150 ℃加熱1 h時(shí)飽和脂肪酸的含量無(wú)明顯變化，200 ℃加熱1 h后小幅度上升；單不飽和脂肪酸中的棕櫚一烯酸和油酸隨溫度升高呈先降低后升高趨勢(shì)，其他單不飽和脂肪酸含量逐漸降低；屬于多不飽和脂肪酸的花生二烯酸在100 ℃加熱1 h時(shí)含量降低，當(dāng)溫度升高至150 ℃和200 ℃時(shí)，其含量穩(wěn)定在0.178%；高溫處理并沒(méi)有影響亞油酸的含量(27.8%)；亞麻酸的含量在在200 ℃加熱1 h時(shí)呈下降趨勢(shì)。油脂中的抗氧化物質(zhì)維生素E在100 ℃加熱1 h時(shí)呈現(xiàn)小幅上升，之后下降，總體呈下降趨勢(shì)(表1)。酸值和過(guò)氧化值是油脂生產(chǎn)、儲(chǔ)存和銷(xiāo)售中評(píng)價(jià)油脂穩(wěn)定性的常用衡量指標(biāo)[11]，酸值是用來(lái)顯示油脂中游離脂肪酸含量的計(jì)量單位，酸值的增加表明高溫誘導(dǎo)牡丹籽油形成了更多的游離脂肪酸；過(guò)氧化值是通過(guò)測(cè)定油脂中總氧化物的數(shù)量來(lái)評(píng)估油脂的氧化程度；高溫能改變植物油的脂肪酸組成，并降低油脂中活性物質(zhì)的含量，使油脂品質(zhì)惡化[13]。本研究表明：高溫降低了牡丹籽油中抗氧化物質(zhì)維生素E的含量，誘導(dǎo)脂肪酸組成發(fā)生改變，最終導(dǎo)致油脂的酸值和過(guò)氧化值的增加，使牡丹籽油的物理化學(xué)性質(zhì)惡化。

表1 高溫處理對(duì)牡丹籽油基本理化性質(zhì)的影響

3.2 牡丹籽油的ATR-FTIR分析

圖1 不同溫度處理下牡丹籽油的ATR-FTIR圖譜

本研究借助ATR-FTIR技術(shù)，對(duì)高溫處理前后牡丹籽油有機(jī)官能團(tuán)的特性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了深入研究。圖1顯示了常溫及高溫處理后牡丹籽油的特征譜帶，其差異性主要表現(xiàn)為吸收峰強(qiáng)度的不同，其位置并無(wú)明顯變化。紅外光譜的吸收峰位置及其對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)如表2所示：牡丹籽油ATR-FTIR圖譜主要包括指紋區(qū)域(600～1 300 cm-1)、C—H鍵變形和彎曲振動(dòng)區(qū)域(1 350～1 500 cm-1)、雙鍵伸縮振動(dòng)區(qū)域(1 730～1 760 cm-1)、氫伸縮振動(dòng)區(qū)域(2 800～3 050 cm-1)。

圖2 不同波數(shù)范圍牡丹籽油的ATR-FTIR圖譜

牡丹籽油三酰甘油酯羰基的振動(dòng)尖峰出現(xiàn)在1 744 cm-1處，經(jīng)高溫處理后，1 744 cm-1振動(dòng)峰隨著溫度的升高譜帶寬度略微加寬，峰強(qiáng)增強(qiáng)。這主要是由于高溫誘導(dǎo)油脂發(fā)生熱氧化，產(chǎn)生醛或其他的次級(jí)氧化產(chǎn)物(如：醇、酮和酸)，這些氧化產(chǎn)物的羰基存在高吸收性，與1 744 cm-1處甘油三酯的酯羰基官能團(tuán)發(fā)生了強(qiáng)帶重疊，同時(shí)，也導(dǎo)致1 744 cm-1處譜帶變寬至較低的頻率[14, 15]。牡丹籽油脂肪酸中存在大量的CH2和CH3基團(tuán)，其C—H鍵的伸縮振動(dòng)在2 855和2 924 cm-1處形成2個(gè)主吸收峰，并在2 956 cm-1處形成肩部吸收峰。此外，牡丹籽油中存在不飽和脂肪酸，其順式雙鍵的C—H伸縮振動(dòng)在3 009 cm-1處產(chǎn)生吸收峰，油脂熱氧化過(guò)程中往往會(huì)消耗順式雙鍵，使其異構(gòu)化成反式基團(tuán)或分解產(chǎn)生次級(jí)氧化產(chǎn)物[11, 16]，然而牡丹籽油此處峰值的峰強(qiáng)卻隨著高溫的增強(qiáng)而加強(qiáng)，表明牡丹籽油在熱氧化過(guò)程中形成了含有順式雙鍵的初級(jí)氧化產(chǎn)物[15, 17]。

圖3 牡丹籽油的吸光值比值

一般情況下，很難界定油脂特性與其抗氧化性間的關(guān)系，有報(bào)道稱(chēng)植物油脂的氧化程度與吸光值比值存在相關(guān)性[11, 15]：A 3 009 cm-1/A 2 924 cm-1(RⅠ)，A 3 009 cm-1/A 2 855 cm-1(RⅡ)和A 3 009 cm-1/A 1 744 cm-1(RⅢ)的比值與油脂不飽和度呈正相關(guān)；A 1 744 cm-1/A 2 924 cm-1(RⅣ)比值與油脂熱氧化程度呈正相關(guān)。圖3顯示了高溫處理對(duì)牡丹籽油吸光值比值(RⅠ-Ⅲ)的影響：在高溫處理下，牡丹籽油的吸光值比值RⅠ-Ⅲ呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，比值RⅡ雖緩慢升高，但不存在顯著性差異(P<0.05)，整體上處于平穩(wěn)狀態(tài)。進(jìn)一步表明：牡丹籽油在熱氧化過(guò)程中油脂不飽和度逐漸降低，并產(chǎn)生了具有順式雙鍵和共軛雙鍵的初級(jí)氧化產(chǎn)物[15, 17]。圖3中吸光值比值RⅣ，隨著溫度的升高，呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，這一結(jié)果與其他植物油存在相似性[11]，表明在一定溫度范圍內(nèi)，高溫誘導(dǎo)牡丹籽油發(fā)生了熱氧化現(xiàn)象，形成了富含羰基基團(tuán)的次級(jí)氧化產(chǎn)物如醛、醇、酮和酸等。

表2 牡丹籽油的紅外光譜分析

3.3 牡丹籽油的1H NMR分析

食用油的化學(xué)本質(zhì)是以甘油為骨架，通過(guò)酯鍵連接起來(lái)的甘油三酯，其主要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在于脂肪酸種類(lèi)的不飽和度。高溫會(huì)造成化學(xué)鍵斷裂(酯鍵)和雙鍵加成，形成新的結(jié)構(gòu)式，使脂肪酸的不飽和度降低，導(dǎo)致油脂氧化變質(zhì)，NMR技術(shù)在植物油脂結(jié)構(gòu)分析上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[10, 18]，本研究進(jìn)一步借助1H NMR技術(shù)，對(duì)高溫處理前后牡丹籽油的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)估。圖4顯示了常溫及高溫處理后牡丹籽油的1H NMR特征峰及其編號(hào)，從高場(chǎng)到低場(chǎng)共出現(xiàn)11個(gè)特征峰，每個(gè)特征峰的化學(xué)位移(δ)及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)子歸屬[10, 12, 18, 19]見(jiàn)表3所示，各類(lèi)質(zhì)子的相對(duì)含量如圖5所示。

圖4 不同溫度處理下牡丹籽油的1H NMR 圖譜

編號(hào)δ歸屬17.27溶劑(CDCl3)25.35所有不飽和脂肪酸雙鍵上的氫(CHCH) 35.29甘油醇上次甲基的氫(CHOCOR)44.13～4.16; 4.28～4.31甘油醇上亞甲基的兩個(gè)氫(CH2OCOR)52.79亞油酸和亞麻酸上位于兩個(gè)雙鍵之間的亞甲基上的氫(CHCHCH2CHCH)62.32與羧基相連的亞甲基上的氫(CH2COOH)72.02不飽和脂肪酸上與雙鍵相鄰的亞甲基上的氫(CH2CHCH)81.61與羧基隔一個(gè)碳的亞甲基上的氫(CH2CH2COOH)91.30所有酰基鏈上的氫((CH2)n)100.95亞麻酸末端甲基上的氫(CHCHCH2CH3)110.89除亞麻酸外,其余脂肪酸末端甲基上的氫(CH2CH2CH2CH3)

注：圖例對(duì)應(yīng)的編號(hào)與表3的一致。圖5 各類(lèi)質(zhì)子的相對(duì)含量

根據(jù)各質(zhì)子峰的歸屬，δ=0.95的特征峰來(lái)源于亞麻酸末端C18上的甲基氫，亞麻酸的雙鍵位于C9、C12和C15上，其末端的甲基氫的化學(xué)位移高于其他脂肪酸[10]，因此將10號(hào)峰歸屬為亞麻酸的特征峰。從圖5a可以看出，從室溫到150 ℃加熱1 h時(shí)，δ=0.95處的10號(hào)H譜峰較為平穩(wěn)，當(dāng)溫度繼續(xù)升高至200 ℃加熱1 h時(shí)，該峰呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明高溫使亞麻酸結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，導(dǎo)致其含量減少，降低了該處H譜峰的強(qiáng)度，因此該處H含量可作為鑒別牡丹籽油熱氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。此外，δ=2.79的5號(hào)峰為亞油酸和亞麻酸上位于兩個(gè)雙鍵之間的亞甲基的特征峰，包含了亞油酸和亞麻酸；δ=5.35的2號(hào)峰為所有不飽和脂肪酸雙鍵的特征峰，包含了油酸、亞油酸和亞麻酸。從圖5可以查看出，在高溫處理過(guò)程中5和2號(hào)峰均存在平穩(wěn)中有輕微下降趨勢(shì)，說(shuō)明高溫處理降低了脂肪酸的雙鍵含量。δ=2.02的7號(hào)峰為與單個(gè)雙鍵共軛的碳上的H化學(xué)位移，進(jìn)一步表明高溫導(dǎo)致牡丹籽油的雙鍵含量降低(圖5b)。δ=1.30的9號(hào)峰為酰基鏈氫的化學(xué)位移，隨著溫度升高，牡丹籽油的雙鍵含量降低，導(dǎo)致酰基鏈上CH2累積量高，該處H含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(圖5b)，也是鑒別牡丹籽油熱氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究在色譜法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步借助ATR-FTIR和1H NMR技術(shù)對(duì)高溫誘導(dǎo)的牡丹籽油氧化特性進(jìn)行了分析。本研究發(fā)現(xiàn)高溫誘導(dǎo)牡丹籽油發(fā)生了熱氧化，氧化程度隨著溫度的增加而增加。ATR-FTIR結(jié)果表明牡丹籽油在高溫作用下脂肪酸的不飽和度降低，形成了含有順式雙鍵的初級(jí)氧化產(chǎn)物以及醛和其他的次級(jí)氧化產(chǎn)物。1H NMR結(jié)果顯示，高溫使亞麻酸結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，并降低了脂肪酸的雙鍵含量，同時(shí)導(dǎo)致酰基鏈上CH2累積量高，提出位于δ=0.95、δ=2.02和δ=1.30處的氫化學(xué)位移可作為鑒別牡丹籽油熱氧化程度的重要指標(biāo)。