黃精多糖的分離、鑒定及免疫調節功效研究*

余亞英

黃精是一種中草藥[1]，是百合科黃精屬植物，種類繁多，常見以根莖入藥，能提高人體的免疫功能[2]，能補氣、潤肺、健脾，還可以抗衰老、抗動脈粥樣硬化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等[3]，研究黃精所含黃精多糖的結構，對細胞免疫調節作用具有重要的意義[4]，本文以研究黃精多糖的分離、鑒定及免疫調節功效為主題，現報道如下。

1 黃精多糖的分離與鑒定

1.1 材料與試劑實驗材料黃精，購買于河南的藥材市場；使用萊陽經濟技術開發區精細化工廠研制的硫酸，北京索萊寶科技公司生產的DPPH、DEAE-Sepharose Fast Flow、ABTS，美國Sigma公司生產的甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、PMP。

1.2 儀器上海天宇新企業發展有限公司生產的多功能粉碎機、日本島津的GC-17AATF氣相色譜儀，Alpha 1-2LDplus牌的冷凍干燥機，北京浦西通用儀器公司生產的紫外可見分光光度計(TU-1900)。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃精多糖的提取取適量的干燥黃精為實驗材料，將黃精研磨粉碎，并過30目篩，然后再碾碎以后的黃精中加入相當于黃精10倍劑量的95%的乙醇溶液，進行回流提取1 h，收集濾渣，進行干燥處理。然后在收集起來的黃精濾渣中加入黃精濾渣的8倍劑量的水，將黃精濾渣與水混合攪勻，再回流提取1 h，再次進行抽濾，收集濾液，然后將收集起來的濾液置于60℃的條件下，進行壓縮操作，將濾液壓縮到一定的體積，然后再將無水乙醇緩慢滴入到濾液中，不斷攪拌，等到乙醇的濃度到達80%以后，將其放入冰箱，冰箱溫度控制在4℃，在冰箱中靜置、沉淀12 h，第2日再進行抽濾操作，最后得到的濾餅就是黃精粗多糖。

1.3.2 黃精多糖的純化對黃精多糖進行純化操作。第一：脫蛋白。在黃精中加入適量的水，溶解黃精，按照體積比1∶3的比例混合溶解后的黃精與Sevage試劑，使其充分混合，靜置，分層。收集上層的水相溶液，去掉下層的變性的蛋白質，將收集到的溶液減壓濃縮，并凍干。第二：脫色。在黃精中加入適量的水，溶解黃精，在溶解后的黃精里加入適量的活性炭進行攪拌1 h，抽濾除掉活性炭，然后同樣將收集到的溶液減壓濃縮，并凍干。

1.3.3 黃精多糖鑒定利用斐林試劑鑒別法、Molisch反應沉淀方法、雙縮脲反應方法、茚三酮反應方法、離子交換色譜分離黃精多糖的方法、柱前衍生化HPLC方法、Size-exclusion chromatography測分子量法、紅外光譜法、MMR分析法對黃精多糖進行鑒定。利用DPPH方法、ABTS方法、鑒定黃精多糖的體外抗氧化能力。

1.4 結果與分析

1.4.1 鑒定結果經鑒定，黃精多糖的斐林試劑反應呈陰性，證明其不含游離的還原性單糖，Molisch反應呈陽性，證明其含有糖類物質，此外，在蛋白質的鑒定中，黃精多糖呈陰性，證明其不含蛋白質。見表1、表2。

表1 多糖鑒別

表2 蛋白質鑒定

1.4.2 黃精多糖的單糖組成經過鑒定分析，D-半乳糖、D-鼠李糖是四種多糖的主要組成部分，4種多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖的含量相對較少。見表3。

表3 單糖組成

1.4.3 黃精多糖的分離純化經過DEAE-Sepharose Fast Flow的分離，黃精多糖得到PSP1、PSP2、PSP3、PSP4 4個部分。PSP是由純水洗脫得到的，是中性多糖。PSP2、PSP3、PSP4是經過氯化鈉溶液洗脫、然后脫鹽、濃縮凍干后而得到的白色或者淺黃色固體，融水。

2 黃精多糖對RAW264.7細胞免疫調節作用

2.1 材料與儀器材料采用黃精多糖提取物；購買自中國科學院上海生命科學園細胞庫的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系。儀器采用Tecan公司的酶標儀、美國Bio-Rad公司的CFX96 PCR儀，電泳儀。上海安亭儀器公司生產的低速臺式離心機、日本Hyrayama公司提供的高壓蒸汽滅菌鍋、美國Eppenddorf公司生產的可調式微量加樣器、美國Alphalnnotech公司提供的Alphalnnotech HP system凝膠成像儀等。實驗試劑采用美國Sigma公司生產的MTT、SRB；澳洲Biological Industries 生產的胎牛血清；東洋紡上海生物科技有限公司的逆轉錄試劑；碧云天生物技術公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒評；上海西塘生物科技有限公司的TNE-a、IL-6 ELISA kit；北京Solarbio公司的RIPA細胞快速裂解液等。

2.2 實驗方法對細胞進行復蘇、培養、傳代操作，然后利用MTT法和SRB法檢測細胞的存活率，再觀察黃精多糖對LDH活性的影響、黃精多糖對細胞形態的影響，并用中性紅法測定RAW264.7細胞的吞噬能力等。

2.3 結果與討論

2.3.1 對細胞存活率的影響本研究利用MTT法、SRB法對黃精多糖進行不同濃度對24 h RAW264.7細胞生長的影響的檢測以后，發現黃精多糖的濃度與細胞的存活率有關系。當黃精多糖的濃度在0～400 μg/ml時，黃精多糖對RAW264.7細胞活性沒有明顯的影響；當黃精多糖的濃度在800 μg/ml以上時，RAW264.7的細胞活性明顯受到影響，由此可知，在日后的實驗中，為了避免細胞毒性對實驗的干擾，應該將黃精多糖濃度控制在低于400 μg/ml的標準內。

2.3.2 對細胞受損的影響經過研究得出，黃精多糖的濃度對細胞的受損程度有一定的影響，當黃精多糖濃度在0～400 μg/ml時 RAW264.7細胞膜完好，無毒性。當黃精多糖的濃度在800 μg/ml以上時，RAW264.7細胞膜遭到破壞，細胞毒性增加[5～8]。

2.3.3 黃精多糖對細胞吞噬能力的影響研究得知，黃精多糖對細胞的巨噬能力能明顯的增強作用，能激活巨噬細胞[9]，當黃精多糖濃度在200～400 μg/ml時，細胞的吞噬能力能明顯提高，并且有一定的劑量依賴性，當黃精多糖的濃度在400 μg/ml以上時，RAW264.7細胞吞噬能力與陽性對照LPS組相近[10]。

3 總結

通過對黃精多糖進行提取、純化、鑒定操作，發現黃精多糖是一種含有糖類物質、不含游離的還原性單糖、不含蛋白質的物質[11，12]。甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖都是黃精多糖的主要單糖組成成分，經過分離純化，可得P1、PSP2、PSP3、PSP4這4種糖，此外黃精多糖的濃度對細胞的存活率、細胞的受損程度、細胞吞噬能力都有作用。