開郁清熱方通過調節胰島細胞凋亡保護胰島功能的機制研究

宋軍， 甄仲， 鄧嵐， 仝小林

（中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053）

糖尿病的發生是由于胰島細胞不能產生足夠胰島素和/或胰島素抵抗所致，其整個病程都伴隨著胰島功能的衰竭。1型糖尿病和2型糖尿病胰島功能衰竭產生的機制是不同的。1型糖尿病主要是胰島β細胞因自身免疫而凋亡，致胰島素生成缺失，炎癥在這個過程中起著很重要的作用。2型糖尿病胰島功能衰竭與細胞因子、游離脂肪酸和持續的高糖環境密切相關，在這些因素的長期影響下，胰島素分泌被抑制，胰島β細胞凋亡增加[1]。胰島素瘤細胞株（INS-1）源自X射線照射的移植胰島瘤的大鼠，胰島素陽性，可合成胰島素原Ⅰ和Ⅱ，是比較公認的一種用于胰島β細胞功能研究的細胞模型[2]，故本研究選取INS-1細胞構建胰島功能衰竭模型。本研究圍繞INS-1凋亡，探討肥胖型2型糖尿病胰島β細胞病變與中藥開郁清熱方的干預作用及機理，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞來源及培養大鼠INS-1細胞由解放軍307醫院贈送。以RPMI-1640培養基加入體積分數10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青鏈霉素，在37℃、體積分數為5%CO2的條件下無菌培養INS-1細胞，每24 h更換培養基1次，待細胞密度達到70%～80%后細胞傳代、凍存。

1.2主要藥物與試劑開郁清熱方（主要由黃連、大黃、白芍、柴胡、天花粉等組成）由天士力集團提供；馬來酸羅格列酮片[葛蘭素史克（天津）有限公司，批號：09060108]。軟脂酸、牛血清白蛋白BSA（美國Sigma公司）；RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）；SYBR Green PCR Master Mix（美國Thermo Fisher Scientific公司）；引物采用primer premier 5.0軟件設計，由上海賽百盛公司合成；兔抗大鼠多克隆抗體p53、Bax、Bcl-2（武漢博士德有限公司，稀釋度為1∶100）。

1.3主要儀器GeneAmp 5700 TaqMAN PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；ImageMaster VDS凝膠圖像分析儀（美國Pharmacia Biotech公司）；Allagra.21R高速冷凍離心機、紫外線分光光度計（德國Backman公司）；DU640型核酸蛋白分析儀（美國Backman公司）；OYY-Ⅲ-5型電泳儀（北京六一儀器廠）；Image Pro Plus圖像分析軟件。

1.4含藥血清的制備SD大鼠30只，雄性，8周齡，體質量180～220 g，平均體質量（200±21）g，購自北京維通利華實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK（京）2012-0001。以開郁清熱方水煎劑按體表面積折算的等效劑量給SD大鼠灌胃[3]，每日2次，連續3 d。血清對照組大鼠給予同體積的生理鹽水灌胃。末次灌胃前禁食12 h，末次灌胃后1 h，腹主動脈采血，靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，經56℃30 min滅活處理后，用0.45μm（或0.22μm）微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存備用。

1.5模型的建立及分組將INS-1細胞分為正常組、高糖誘導組、血清對照組、中藥小劑量組、中藥大劑量組、羅格列酮組共6組。每組5個復孔。

1.5.1 正常組 取同代INS-1細胞置于含完全RPMI-1640培養基培養5 d，后以完全RPMI-1640培養基換液繼續培養12 h。

1.5.2 高糖誘導組 取同代INS-1細胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L的培養液內培養5 d，后以完全RPMI-1640培養基換液繼續培養12 h。

1.5.3 血清對照組 取同代INS-1細胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L的培養液內培養5 d，后以正常大鼠血清的完全RPMI-1640培養基繼續培養12 h。

1.5.4 中藥小劑量組 取同代INS-1細胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L內培養5 d，后以5%含藥血清的完全RPMI-1640培養基繼續培養12 h。

1.5.5 中藥大劑量組 取同代INS-1細胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L內培養5 d，后以10%含藥血清的完全RPMI-1640培養基繼續培養12 h。

1.5.6 羅格列酮組 取同代INS-1細胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L內培養5 d，后以含1 mol/L羅格列酮鈉片的完全RPMI-1640培養基繼續培養12 h。

1.6指標檢測與方法

1.6.1 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集數目（1～5）×106個/mL細胞，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。3 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預冷的體積分數70%的乙醇4℃固定1～2 h。離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min。400目的篩網過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。用1 mol/L碘化丙啶（PI）染液染色，4℃避光30 min后，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測Sirt1、叉頭狀轉錄因子O1（FOXO1）mRNA表達 選用β-actin作為內參照以進行RT-PCR半定量分析。設計引物如下：①r-Sirt1-F：5’-TTGGCACC GATCCTCGAA C-3’；r-Sirt1-R：5’-CCCAGCTC CAGTCAGAACTAT-3’。②r-FOXO1-F：5’-ATC CGCTGCCTGCAGTGGACC-3’；r-FOXO1-R：5’-C CTTGTCCAGCATGAGGTTCTCC-3’。③β-actin-A：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；β-actin-S：5’-AATGTCACGCACGATTTCCC-3’。RT-PCR反應體系按試劑盒說明書進行制備。擴增反應條件：95℃5 min；95℃25 s，55℃25 s，72℃50 s，40個循環；72℃5 min。反應結束計算CT值，為避免假陽性信號，使用熔解曲線來檢查非特異性產物的構成。以β-actin基因為內標參照，使用比較法（△△CT）來計算基因的相對定量（p）。

1.6.3 免疫組化法檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax、p53蛋白表達 將做好的細胞爬片在室溫自然干燥后置于體積分數95%乙醇中固定20 min，于室溫下在3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水洗2次。微波熱修復抗原，然后室溫冷卻。PBS清洗，擦干，加山羊血清封閉20 min，傾去血清，直接加兔抗大鼠多克隆抗體p53/Bax/Bcl-2（稀釋度均為1∶100），4℃濕盒過夜。PBS清洗，加山羊抗兔IgG，37℃20 min，PBS清洗，加鏈酶親和素—過氧化物酶抗體（SABC）試劑，37℃20 min，PBS清洗，DAB顯色，最后蘇木素輕度復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性結果以高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，以細胞或細胞核中出現棕黃色為陽性反應，計數陽性細胞數的百分率。陰性對照以PBS代替一抗，其余同。

1.7統計方法采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，所有數據以均數±標準差（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進而用最小顯著差異法（LSD）進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 各組INS-1細胞凋亡率比較Table 1 Comparison of the apoptosis rate in INS-1 cells of various groups （s，p/%）

表1 各組INS-1細胞凋亡率比較Table 1 Comparison of the apoptosis rate in INS-1 cells of various groups （s，p/%）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與高糖誘導組比較；③P＜0.05，與血清對照組比較；④P＜0.05，與羅格列酮組比較

細胞凋亡率1.46±0.37③31.10±4.76①31.20±4.57①27.74±3.44①④20.99±3.42①②③20.98±2.95①②③組別正常組高糖誘導組血清對照組中藥小劑量組中藥大劑量組羅格列酮組n6 6 6 6 6 6

2 結果

2.1各組INS-1細胞凋亡率比較表1、圖1結果顯示：與正常組比較，高糖誘導組，血清對照組，中藥大、小劑量組及羅格列酮組INS-1細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）；與高糖誘導組和血清對照組比較，中藥大劑量組、羅格列酮組INS-1細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），且2組作用效果近似。表明大劑量開郁清熱方可有效保護胰島β細胞，減低胰島β細胞凋亡。

圖1 各組INS-1細胞凋亡的流式細胞圖Figure 1 The flow cytometry plot for the apoptosis of INS-1 cells in various groups

圖2 各組INS-1細胞Sirt1、FOXO1 mRNA表達的比較Figure 2 Comparison of the mRNA expression levels of Sirt1 and FOXO1 in various groups（s，n=3）

2.2各組INS-1細胞Sirt1、FOXO1 mRNA表達的比較圖2結果顯示：與正常組比較，高糖誘導組和血清對照組INS-1細胞Sirt1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），FOXO1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖誘導組和血清對照組比較，中藥大、小劑量組INS-1細胞Sirt1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），FOXO1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），羅格列酮組INS-1細胞僅Sirt1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。提示開郁清熱方可抑制胰島β細胞凋亡，其機制可能與升高胰島β細胞Sirt1 mRNA表達，降低FOXO1 mRNA表達有關。

2.3各組INS-1細胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達的比較表2、圖3～5結果顯示：與正常組比較，高糖誘導組和血清對照組INS-1細胞Bax、p53蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與高糖誘導組和血清對照組比較，中藥大劑量組、羅格列酮組INS-1細胞Bax蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。雖然與高糖誘導組比較，中藥大劑量組及羅格列酮組p53蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05），但這2組p53較血清對照組顯著降低（P＜0.05）。表明大鼠血清可影響INS-1細胞p53的表達，大劑量開郁清熱方及羅格列酮對p53有一定的降低作用。提示開郁清熱方可抑制INS-1細胞凋亡，其機制可能與升高INS-1細胞Bcl-2蛋白表達，降低Bax、p53蛋白表達有關。

表2 各組INS-1細胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達的比較Table 2 Comparison of the protein expression levels of Bax，Bcl-2 and p53 in various groups（s，n=3）

表2 各組INS-1細胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達的比較Table 2 Comparison of the protein expression levels of Bax，Bcl-2 and p53 in various groups（s，n=3）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與高糖誘導組比較；③P＜0.05，與血清對照組比較；④P＜0.05，與羅格列酮組比較

p53 0.083±0.019 0.129±0.022①0.148±0.018①②0.138±0.027①0.119±0.01①③0.123±0.009①③組別正常組高糖誘導組血清對照組中藥小劑量組中藥大劑量組羅格列酮組Bax 0.090±0.016 0.135±0.014①0.146±0.003①0.132±0.011①④0.107±0.009②③0.099±0.008②③Bcl-2 0.135±0.033 0.094±0.002①0.098±0.012①0.121±0.003④0.123±0.009②③④0.149±0.021②③

圖3 各組INS-1細胞Bax蛋白表達的比較（免疫組化法，×400）Figure 3 Comparison of the protein expression of Bax in INS-1 cells of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖4 各組INS-1細胞Bcl-2蛋白表達的比較（免疫組化法，×400）Figure 4 Comparison of the protein expression of Bcl-2 in INS-1 cells of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖5 各組INS-1細胞p53蛋白表達的比較（免疫組化法，×400）Figure 5 Comparison of the protein expression of p53 in INS-1 cells of various groups（by immunohistochemistry，×400）

3 討論

3.1開郁清熱方對胰島β細胞凋亡的作用近年來，糖尿病患者日趨增多，且隨著糖尿病患者病程的持續，其胰島β細胞數量逐漸減少，胰島β細胞功能呈進行性下降。細胞凋亡是胰島β細胞數量減少的最終形式，而胰島β細胞衰竭所致的胰島素分泌不足是血糖升高的主要原因。目前，針對胰島β細胞凋亡的防治手段非常有限，因此有必要開發對胰島β細胞具有保護作用的藥物[4]。開郁清熱方是仝小林教授在“脾疸”理論指導下研發的治療2型糖尿病（肝胃郁熱證）的中藥方劑，有開郁清胃、滋陰降火、通腑瀉濁的功效。課題組前期研究結果表明，開郁清熱方（糖敏靈）可有效地控制初治、超體質量2型糖尿病患者的糖化血紅蛋白，達標率大于50.0%，明顯高于安慰劑組。開郁清熱方（糖敏靈）可明顯降低空腹血糖、餐后2 h血糖，血糖實測值、達標率均明顯高于安慰劑[5]。

本研究選取被廣泛用于研究β細胞生長及存活因子的胰島β細胞系，進行高糖培養以誘導胰島細胞功能損傷模型[6，7]，通過含藥血清干預進一步探討開郁清熱方對INS-1細胞凋亡的防治作用。結果顯示，開郁清熱方大劑量組及羅格列酮組均能有效降低高糖誘導的INS-1細胞凋亡率，且2組作用效果近似。表明經大劑量開郁清熱方處理后可有效保護胰島β細胞細胞，減低胰島β細胞凋亡。

3.2開郁清熱方對INS-1細胞Sirt1、FOXO1的調節作用Sirt基因家族主要通過參與染色質沉默以及能量代謝而調節細胞的衰老過程。其中Sirt1編碼的蛋白為核蛋白，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的脫乙酰酶，有研究證實在不同組織中Sirt1發揮著促進脂肪動員[8]、降低轉化生長因子β誘導的凋亡[9]、抑制增殖[10]、增加胰島素分泌[11]等作用。FOXO1是叉頭轉錄因子O家族成員之一，受Sirt1調節。Yang等[12]研究揭示，在細胞核內Sirt1蛋白可結合并去乙酰化FOXO1。在哺乳動物細胞中，Sirt1通過在叉頭DNA結合區內將3個賴氨酸殘基脫乙酰化來調節FOXO1的活性[13]。活化的FOXO1進一步影響Bax、Bcl-2、p53等，從而影響INS-1細胞的凋亡。

本研究結果表明，開郁清熱方可能通過有效升高INS-1細胞Sirt1 mRNA表達，降低FOXO1 mRNA表達，從而調控相關信號通路影響胰島β細胞的凋亡。

3.3開郁清熱方對INS-1細胞Bcl-2、Bax、p53的調節作用Bcl-2與Bax共屬于一個家族，通過控制線粒體膜的通透性來調節凋亡激活物如細胞色素C的釋放來影響細胞的狀態。Bax二聚體在膜上打開通道，增加通透性；Bcl-2與Bax形成異聚體，降低通透性。故Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，可看作是保護藥物起作用的標志；而反之則相反[14]。有研究表明，Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用，而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，具有促凋亡作用，p53可上調Bax的表達以及下調Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡的作用[15]。

本研究結果表明，大劑量開郁清熱方可有效升高Bcl-2蛋白表達，降低Bax、p53蛋白表達，從而抑制胰島β細胞的凋亡過程，增加細胞數量，促進胰島素的分泌。另外，在研究過程中，因Sirt1和Akt蛋白表達較低未能測出，故僅提供PCR研究結果。