聚γ-氨基丁酸修飾電極測定食品中的萊克多巴胺

陳美鳳，孫章華，程道娟，趙延慧，馬心英*

1(菏澤學院 化學化工學院，山東 菏澤，274015) 2(山東菏澤市環境監測中心站,山東 菏澤，274000)

萊克多巴胺(ractopamine，RAC)是一種人工合成的腎上腺受體激動劑，在醫學上用來治療心力衰竭癥、肌肉萎縮癥或者減少脂肪蓄積，并對胎兒和新生兒生長有一定的益處。在動物飼養中能減少動物脂肪累積，使瘦肉增加，改善肉質，同時還使得動物飼料利用率和蛋白質含量得到提高[1-2]。但攝入過量的RAC，人體會出現不同程度的中毒反應，其中毒癥狀表現為肌肉震顫、四肢麻痹、心動過速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、惡心眩暈等，重者可引發高血壓、心臟病甚至危及生命[3-6]。2002年，我國農業部、原衛生部、原國家藥品監督管理局聯合發布《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》(農業部公告第176號)禁止RAC在動物養殖中的使用RAC。俄羅斯和歐洲國家也都禁止RAC作為食品添加劑[7]，所以建立RAC的快速測定是非常必要的。

目前，常用于測定RAC的方法主要有氣相色譜法(GC)[8]，液相色譜法(HPLC)[9-10]，氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[11-12]，液相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[13-14]、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)[15-16]以及分子印跡法[2,17]。然而，這些方法中有些方法需要昂貴的儀器、熟練的操作人員和制備大量的樣品；有些試驗中存在試劑穩定性差和需要進行動物試驗，導致其對食品樣品中RAC的現場檢測和快速檢測的適用性有限的缺陷。而電化學方法穩定、靈敏、成本低，特別是在藥物和食品分析方面得以廣泛應用。有些電化學傳感器已經應用于RAC的檢測[18-24]。氨基酸聚合膜修飾電極具有穩定性好、選擇性好、檢測的靈敏度高和使用壽命長等特點，被廣泛用于化學修飾電極的制備[25]。聚γ-氨基丁酸(γ-ABA)具有良好的電催化特性，是一種優良的電極的修飾材料，在電化學領域應用前景非常廣泛，聚γ-ABA修飾電極(P-γ-ABA/GCE)已經應用于一些電化學活性物質的檢測，表現出了優良的催化活性[26-28]。但據我們所知，P-γ-ABA/GCE測定RAC還未見報道。本文采用在P-γ-ABA/GCE對RAC進行測定，電極表現出了較好的穩定性及抗干擾能力，催化了RAC的氧化反應，能夠用于實際樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電化學工作站CHI660D型，上海辰華儀器有限公司；三電極體系，飽和Ag/AgCl電極為參比電極、鉑絲電極為輔助電極、玻碳電極(GCE)或P-γ-ABA/GCE為工作電極；KQ-100型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；石英亞沸高純水蒸餾器SYZ-550，金壇市江南儀器廠。

γ-ABA，阿拉丁試劑有限公司；RAC標準品，農業部環境保護科研監測所；豬肉，購買于當地超市；0.2 mol/L的緩沖溶液(PBS)由Na2HPO4和NaH2PO4配制；試驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 P-γ-ABA/GCE的制備

將玻碳電極在麂皮上用氧化鋁粉末的糊狀液拋光，然后分別在硝酸、乙醇和水中分別超聲清洗30 s，再用二次蒸餾水沖洗干凈晾干備用。將預處理后的玻碳電極放置于含有0.1 mol/L KNO3的5.0 mmol/L K3[Fe(CN)]6溶液中，使用循環伏安法(CV)掃描，當峰電流不再變化且趨于穩定，即電極清洗和活化過程完成。將電極置于1.0×10-3mol/L的γ-ABA溶液中，在-1.4～2.2 V電位范圍內以40 mV/s的掃描速率循環掃描8段，取出電極清洗待用。

1.3 電化學分析試驗方法

將三電極體系放置于一定量的RAC標準溶液(pH=6.8的PBS配制)與PBS中，用CV或差分脈沖伏安法(DPV)掃描，觀察并記錄在GCE或P-γ—ABA/GCE電化學行為。

2 結果與分析

2.1 RAC的電化學行為

由圖1可知，濃度為1.00×10-6mol/L的RAC溶液在P-γ-ABA/GCE上的氧化峰電流(3)相對于在裸電極(2)上的氧化峰明顯增大，可以看出，γ-ABA增大了檢測靈敏度。說明P-γ-ABA對RAC氧化具有催化作用，加速了RAC的電子轉移速率。

1-γ-ABA/GCE測定空白溶液 (0.2 mol/L, pH=6.8);2-裸電極測定1.0×10-6 mol/L RAC;3-P-γ-ABA/GCE測定1.0×10-6 mol/L RAC圖1 不同電極測定的DPV圖Fig.1 DPV curves of different electrode measurement

2.2 最佳電化學聚合條件

2.2.1 P-γ-ABA/GCE聚合溶液的pH

聚合溶液pH影響了電極的性能。為了確定最佳聚合溶液的pH，固定電位于-1.4～2.2 V， 40 mV/s的掃描速率下，僅改變聚合溶液的pH。試驗表明：當pH達到6.5時，RAC在聚P-γ-ABA/GCE上的氧化峰電流達到最大值(圖2)，因此，在本試驗中選擇含有γ-ABA的pH=6.5的緩沖溶液作為修飾溶液。

圖2 P-γ-ABA/GCE聚合液最佳pHFig.2 Optimization of the pH of the polymer stocksolution of P-γ-ABA/GCE

2.2.2 P-γ-ABA/GCE掃描段數(n)的優化

試驗中討論了n對聚合物修飾電極的影響。通過改變n聚合得到的修飾電極來測定RAC，試驗結果表明(圖3)，聚合過程中n達到8段時，RAC在P-γ-ABA/GCE上的氧化峰電流值達到最大。因此，聚合最佳n是8段。

圖3 P-γ-ABA/GCE最佳聚合段數(n)Fig.3 Optimization of the number ofelectropolymerization cycles (n) of P-γ-ABA/GCE

2.2.3 P-γ-ABA/GCE聚合掃描速率的優化

聚合掃描速率對修飾電極也起到較大的影響。通過改變掃描速率來觀察氧化峰電流的電流變化。試驗結果顯示，當修飾電極上掃描速率是40 mV/s，RAC的氧化峰電流值達到最大(圖4)。所以，最佳聚合掃描速率選用40 mV/s。

圖4 P-γ-ABA/GCE最佳聚合掃描速率Fig.4 Optimization of the scanning rate of P-γ-ABA/GCE

2.2.4 P-γ-ABA/GCE聚合高電位、低電位的優化

P-γ-ABA/GCE電極的制備中，聚合高、低電位能夠在一定程度上影響電極的檢測靈敏度。首先固定低電位為-1.0 V，改變聚合高電位進行試驗。最佳高電位為2.2 V。然后固定高電位，最佳低電位為-1.4 V。此時，RAC在修飾電極上的響應氧化峰電流達到了最大值(圖5)。所以聚合電位為-1.4～2.2 V。

a-低電位聚合；b-高電位聚合圖5 P-γ-ABA/GCE最佳聚合電位Fig.5 Optimization of the potential of P-γ-ABA/GCE

2.2.5 優化條件下P-γ-ABA/GCE電極聚合曲線

在上述最佳聚合條件下，用循環伏安法得到了P-γ-ABA/GCE電極的聚合曲線。γ-ABA在電極表面發生了氧化還原反應，通過電化學氧化還原反應制備了聚合物膜。

聚合條件：1.0×10-3mol/L的ABA；聚合電位：-1.4～2.2 V；聚合掃描段數：8段；掃描速率：40 mV/s。

2.3 RAC最佳測定條件的選擇

2.3.1 測定溶液最佳pH

電極反應受到測定溶液pH的影響。為了考察測定過程中測定溶液pH的影響，在0.2～1.0 V的電位范圍內，改變測定底液的pH。在pH為6.0到8.0之間，RAC在P-γ-ABA/GCE上氧化峰電流變化如圖6所示。當pH=6.8時，RAC在P-γ-ABA/GCE上的氧化峰電流達到最大值。因此，在該試驗中選擇pH=6.8的PBS為測定底液。另外，由圖6插圖可以看出，RAC氧化電位與pH值成線性相關；pH在6.0～8.0，氧化峰電位(Epa)隨pH值的增加而降低，線性回歸方程為：Epa=1.05-0.053 pH，R=0.996 3，其線性方程的斜率為0.053 V，接近0.059 V，故質子轉移數等于電子轉移數，由此可說明RAC在氧化過程中涉及質子的參與。

1～6 (pH)-6.0, 6.4, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0圖6 不同pH下的1.0×10-6 mol/L的RAC在P-γ-ABA/GCE上的差分脈沖圖Fig.6 DPV curves (DPVs) of 1.0×10-6 mol/L RAC atthe P-γ-ABA/GCE

2.3.2 掃描速率的影響

設置電位范圍為0.2～1.2 V，選擇1.0×10-6mol/L的RAC溶液，選擇pH=6.8的PBS，用循環伏安法研究掃描速率的變化規律(圖7)。

1～14-20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240 mV/s圖7 不同掃速下的CV圖Fig.7 Cyclic voltammograms at deferent scan rate

試驗結果證明，在20～240 mV/s的速率，氧化峰電流值隨著掃描速率的增加而增大，并且氧化峰電流與掃描速率ν1/2成線性關系，線性方程ipa=4.03×10-7+1.57×10-9ν1/2(mV/s)，相關系數R2=0.994 1，說明RAC在聚氨基丁酸修飾電極上的反應過程為擴散過程。

2.4 線性范圍

在最佳的試驗條件下，使用差分脈沖伏安法測定RAC(DPV曲線如圖8所示)。在6.0×10-8～1.0×10-5mol/L，OX電流與其濃度成相對比較好的線性正相關(如圖8插圖所示)，線性回歸方程為：ipa=1.09×10-7+0.26c(mol/L)，R2=0.998 8。RAC的最低檢出濃度為8.0×10-9mol/L。

2.5 樣品的測定

2.5.1 樣品處理

稱取10.000 0 g生豬肉，用大約20 mL的無水乙醇將樣品浸泡，靜置10 min，用真空泵抽濾，濾渣用乙醇萃取3次，合并濾液，取適量倒入離心試管，放入離心泵離心10 min，取上層上清液定容于10 mL容量瓶中配制成豬肉樣品待測液。

2.5.2 樣品回收率測定

在優化的試驗條件下，取豬肉樣品待測液0.5、1和2 mL，用標準加入法向豬肉樣品待測液中加RAC溶液，回收率在98.0%～102%，計算結果如表1。

2.6 電極的抗干擾能力、穩定性與重復性

用P-γ-ABA/GCE測定濃度為6.00×10-6mol/L的RAC(pH=6.8)進行干擾試驗，評估了可能干擾修飾電極響應的幾種物質。試驗結果表明，在允許相對誤差±5.0%以內，100倍的葡萄糖(Glc)和半乳糖(Fru)，50倍的甘氨酸(Gly)和尿酸(UA)，20倍的抗壞血酸(AA)，加入到6.00×10-6mol/L的RAC中，在此體系中只檢測到UA到相對微弱的氧化峰，其他物質未檢測到峰，并且沒有影響RAC氧化峰電流的大小，所以該方法具有較好的選擇性。

1～11-0.06, 0.08, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 2.0,4.0, 6.0, 8.0,10 μmol/L圖8 P-γ-ABA/GCE上不同濃度的RAC在最佳試驗條件下的DPV圖Fig.8 DPV curves of different concentrations of RACat the P-γ-ABA/GCE

表1 豬肉樣品中RAC的回收率的測定(n=6)Table 1 Results of tests for recovery

將制備好的電極連續掃描6次，電流響應僅下降1.5%。然后將其置-4℃避光保存，7 d后響應電流變化率不超過5.0%，表明該傳感器的穩定性較好。分別制備同一批次3支電極對RAC進行檢測電流變化率不超過3.9%，表明該電極有較好重復性。

3 結論

本試驗制備了P-γ-ABA/GCE，用于測定RAC，該方法操作簡單，靈敏度高，有較好的穩定性、重現性及抗干擾能力，試驗中用于實際樣品的檢測，結果滿意。因此，該方法在食品中RAC的檢測方面有較好的應用前景。