柚皮納米纖維素的制備工藝優化及形態特征

范佳瑩，李則靈，朱霞建，談安群，易鑫，周琦，譚祥，黃林華，王華

(西南大學柑桔研究所，中國農業科學院柑桔研究所，重慶，400712)

纖維素是自然界中含量豐富的天然聚合物。在分子水平上，不同來源的纖維素都是相同的，即通過β-1,4糖苷鍵連接在一起的D-葡萄糖單元的無支鏈聚合物，但是纖維素在其晶體結構方面不一定相同[1]。純纖維素晶型具有幾種不同的排列結構，分別為纖維素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型。其中，只有纖維素Ⅰ型是天然存在的，其他(Ⅱ型，Ⅲ型和Ⅳ型)均可由Ⅰ型通過化學處理制備[2]。納米纖維素(nano-crystal cellulose, NCC)是一種重量輕、密度低(約1.6 g/cm3)、強度性能優異的可生物降解納米纖維[3]，其表面具有豐富的羥基官能團[4]，相較于微晶纖維素(microcrystalline cellulose，MCC),它具有更高的純度、結晶度、親水性、可及性、生物相容性和自組裝特性[5]，可以用來制備功能性材料[6]。因此NCC受到化工、食品、醫藥等領域的青睞。制備NCC的方法主要有化學法(酸水解法等)、物理法(球磨法等)、生物法(酶法等)，以及三者兩兩結合法等。酸水解法是目前制備納米纖維素最成熟、穩定的一種方法，其中硫酸水解法不僅能較好地分離納米纖維素，而且能使納米纖維素表面的羥基與硫酸根離子發生酯化反應，形成分散穩定的膠體體系[7-8]。雖然各類型纖維素的化學成分相似，但由于來源和提取方法的不同，它們在形貌、粒度、結晶度和某些性質上有所不同[9]。因此本文旨在探究以柚皮為原料制備的納米纖維素的形態特征，為柚皮的深度開發提供新途徑。

豐都紅心柚風味獨特，具有入口化渣、酸甜可口和果皮較厚等特點。其果皮中含有豐富的纖維素[10]、果膠[11]和以柚皮苷為主的黃酮類物質[12]，其中果膠、黃酮類物質的提取及利用方面的研究報道較多，而在柚皮纖維素的提取與利用方面的研究報道并不多見[13-14]。為避免生產加工過程中因皮渣丟棄造成的環境污染、經濟損失和資源浪費，提高柚子副產物的綜合利用，本文在制備出柚皮MCC的基礎上，采用硫酸水解法進行柚皮NCC的制備，以單因素試驗和響應面分析法優化制備條件，并對制備出的NCC進行形態表征與結構分析,以期在開發柚皮纖維素新用途的同時，為處于研究熱點的納米纖維素提供新的植物來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐都紅心柚，采購于重慶市豐都縣三元鎮。

NaOH，成都市科隆化學品有限公司；H2SO4、HCl、H2O2、無水乙醇，重慶川東化工有限公司；以上均試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

6202型高速粉碎機，北京燕山正德機械設備有限公司；HW.SY11-KP2型智能恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表公司；電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；GZX-9240 MBE型數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；Nicolet/is5010400型傅里葉變換紅外光譜儀，重慶佳佰能儀器有限公司；X'Pert3 Powder10300型X射線衍射儀，荷蘭帕納特儀器有限公司；SU8020型場發射掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚皮纖維素的提取及柚皮微晶纖維素的制備

參考曾小峰等[15-16]優化的超聲波輔助化學法進行柚皮纖維素的提取與微晶纖維素的制備。

將粉碎后的柚皮粉以1∶20(g∶mL)的料液比與0.1 mol/L的HCl混合，85℃水浴2 h后抽濾，取濾渣用蒸餾水洗至中性后于60℃下烘干。將除去果膠的柚皮粉以1∶20的料液比與94 g/L的NaOH溶液混合，在超聲功率200 W、溫度84℃下超聲77 min，抽濾并取濾渣，蒸餾水洗滌3次后，按1∶20的料液比加入體積分數為8%的H2O2溶液，使用NaOH調溶液pH至11左右，于30℃下反應30 min，蒸餾水洗滌濾渣至中性，用乙醇(體積分數為95%)洗脫色素等雜質，60℃烘干，得到柚皮纖維素。

將柚皮纖維素以1∶20的料液比置于體積分數為8 %的HCl中60℃下酸解80 min后過濾，蒸餾水將濾渣洗至中性，60℃烘干，即得柚皮微晶纖維素。

1.3.2 柚皮納米纖維素的制備

將柚皮MCC與一定質量分數的H2SO4以1∶10(g∶mL)的比例混合，在一定溫度下反應一定時間，升溫過程不超過5 min，反應期間不斷攪拌。到達反應時間后立即用10倍蒸餾水終止反應，即得NCC懸浮液。用等量蒸餾水在8 000 r/min，10 min的條件下離心洗滌4～5次，即得下層乳白色的NCC懸浮液。將其置于透析袋中透析至pH不再變化。對透析后的懸浮液進行超聲分散20 min，通過冷凍干燥得到NCC固體粉末[17]。

1.3.3 納米纖維素得率的測定

測量柚皮納米纖維素膠體的總體積，移取20 mL懸浮液置于稱量瓶中，60℃烘至恒重，將其放入干燥器中冷卻30 min后稱重[18],納米纖維素得率計算如公式(1)：

(1)

式中：m，原料的質量，g；m1，稱量瓶與烘干后樣品的總質量，g；m2，稱量瓶的質量，g；V1，納米纖維素膠體的總體積，mL；V2，移取的體積，mL。

1.3.4 NCC單因素試驗設計

以柚皮納米纖維素的得率作為評價指標，按照1.3.2中的制備工藝，依據表1列出的因素條件進行單因素試驗分析。在進行單因素試驗中，除選擇的因素外，其余因素均選用水平3的條件進行試驗。

表1 單因素水平設計表Table 1 Levels design of single factor experiment

1.3.5 響應面試驗優化制備條件

基于單因素試驗結果，選取對試驗結果影響較大的H2SO4質量分數、反應溫度、反應時間3個因素作為自變量，采用Box-Behnken設計3因素3水平響應面試驗，因素與水平設計如表2。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels used in response surface experiments

1.3.6 場發射掃描電鏡分析(SEM)

將超聲分散后的納米纖維素懸浮液滴在硅片上自然干燥后，將樣品進行噴金處理后放在場發射掃描電子顯微鏡下，觀察柚皮納米纖維素的大小和形態。

1.3.7 傅立葉紅外光譜分析(FT-IR)

以1∶200(g∶g)將樣品與KBr混合壓片，將壓片的樣品放在紅外光譜儀上進行4 000～400 cm-1檢測。

1.3.8 結晶度分析(XRD)

將樣品粉末放入X射線衍射儀的衍射槽內進行掃描范圍2θ=5～40°，步長0.02°，掃描速率2°/min的測試。采用經驗公式-Segal公式(2)計算樣品的相對結晶度(crystallinity index, CI)[19]：

(2)

式中:I002，002面(2θ=22.18°) 晶格衍射峰強度；Iam，纖維素無定形區衍射峰強度(2θ=18°)

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 H2SO4質量分數對NCC得率的影響

由圖1可知，NCC得率隨H2SO4質量分數含量的逐漸增加，呈現出先增大后減小的趨勢，當質量分數為62%時，得率最高為57.40%。當質量分數為58%、60%時，得率不高的原因可能是H2SO4質量分數的降低不足以在特定的時間內水解無定形區，從而導致水解不充分；同時，由于纖維素在濃酸中存在溶脹反應[20]，在酸含量較低的情況下，纖維素不能充分進行溶脹反應，導致產物粒徑過大達不到納米級尺寸，影響了得率。當H2SO4質量分數為62%時，酸濃度較適宜，纖維素水解反應充分，溶脹率高，產物粒徑小，得率最高。隨著酸含量的繼續增大，試驗發現反應制得的纖維素懸浮液不再呈現乳白色，而是趨近黃色，這可能是由于H2SO4含量過大，將纖維素的糖苷鍵水解成葡萄糖[21]，進而呈現黃色半透明溶液，得率下降。當H2SO4質量分數達到70%時，纖維素呈現焦黑色，無法制備出納米纖維素。

圖1 硫酸質量分數對NCC得率的影響Fig.1 Effects of sulfuric acid mass fraction onthe yield of nanocellulose from pomelo’s mesocarp注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

2.1.2 反應溫度對NCC得率的影響

由圖2可知，當溫度為40℃時，NCC得率很低，僅有7.44%，說明溫度過低，不足以使纖維素水解完全，水解產物粒徑過大，導致得率很低。隨著反應溫度的逐漸升高，酸催化劑中的質子運動愈發活躍，其與纖維素中糖苷鍵的反應速率加快[22]，酸解反應進行的更加充分，NCC得率逐漸提高。當溫度達到50℃時，得率達到最高值60.49%，隨后開始下降，可能是由于溫度過高，纖維素分解速率過快，在相同的時間內，反應生成的納米纖維素也被部分水解成了糖類物質，導致得率減少。

圖2 反應溫度對NCC得率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on theyield of nanocellulose from pomelo’s mesocarp

2.1.3 反應時間對NCC得率的影響

由圖3可知，隨著反應時間的增加，得率呈現出先增大后迅速減小的趨勢，當反應時間為75 min時，得率達到最大值64.39%，出現這種變化趨勢的原因是時間過短，不足以使酸與糖苷鍵充分作用，酸解不完全，得率較低；隨著時間的不斷延長，酸繼續與纖維素作用生成葡萄糖等糖類物質，水解過度，懸浮液開始變黃，產率下降。

圖3 反應時間對NCC得率的影響Fig.3 Effects of reaction time on the yield ofnanocellulose from pomelo’s mesocarp

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面設計方案與實驗結果

以單因素試驗結果為依據，選取H2SO4質量分數、反應溫度和反應時間3個因素，以NCC得率為指標，采用Design-Expert8.0.6軟件進行3因素3水平的響應面試驗設計與分析。試驗設計及結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

注：*,P< 0.05，差異顯著；**,P< 0.01，差異極顯著。

2.2.3 響應面分析與尋優

根據回歸方程，得到各因素交互作用對NCC得率影響的響應面圖和等高線圖(圖4)。由圖4-a中等高線圖可以看出，等高線呈微橢圓形，說明A(H2SO4質量分數)、B(反應溫度)兩因素存在交互作用且對得率的影響較顯著(P< 0.05)；由3D曲面圖可看出，當反應時間不變時，隨著H2SO4含量(質量分數)的增大和反應溫度的升高，納米纖維素得率均呈現先升高后下降的變化趨勢，曲面在H2SO4含量的-0.50～0.50水平和反應溫度的-0.50～0.00水平出現極值，即為最大值。由圖4-b中曲面圖可以看出，當固定反應溫度時，NCC得率隨著H2SO4含量的增大呈現先升高后下降的趨勢，而隨著反應時間的延長，NCC得率呈現先逐漸上升而后略微下降的趨勢，圖中可明顯看出H2SO4含量變化曲面較反應時間更陡，說明H2SO4含量對NCC得率的影響比反應時間對其的影響更為顯著；等高線圖中發現等高線呈現橢圓形，說明A(H2SO4質量分數)、C(反應時間)兩因素的交互作用對得率影響顯著(P<0.01)，這與方差分析的結果一致。圖4-c中曲線圖呈現出當H2SO4含量一定時，NCC得率受反應溫度的影響較反應時間更顯著，在反應溫度的-0.50～0.50水平和反應時間的-1.00～0.00水平，曲面出現最高點，即為得率最高的反應時間、溫度條件；等高線圖顯示B(反應溫度)、C(反應時間)兩因素交互作用明顯且對得率結果影響顯著(P<0.01)。

圖4 各因素交互作用對納米纖維素得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing theeffect of various factors on nanocellulose yield

2.2.4 驗證試驗

通過響應面回歸方程計算與分析預測出的最優制備條件為：H2SO4質量分數62.11%，反應溫度50.42℃，反應時間78.31 min，此條件下計算出的最高NCC得率為63.86%?？紤]到實際操作情況，將條件調整為H2SO4質量分數62%，反應溫度50℃，反應時間78 min。為驗證該模型的可靠性，采用最優條件進行驗證試驗，得NCC得率為63.27%，與理論值接近，說明分析結果可靠，可以較好地預測實際值。

2.3 SEM分析結果

圖5為2種不同放大倍數下的柚皮納米纖維素場發射掃描電鏡圖。由圖5可以看出柚皮NCC呈類球狀，粒徑在100～200 nm，大小一致且分布均勻，部分粒子之間存在團聚的現象，這是由于NCC表面具有大量的羥基，經水解處理后，纖維素尺寸變小，比表面積增大，其表面的羥基更易相互結合形成氫鍵[23]，從而產生團聚的現象。與之前研究制備出的MCC[15]相比，硫酸水解反應使MCC原本不規則且表面粗糙的結構減小為納米級且大小均勻的類球狀結構，比表面積進一步增大，使MCC的物化性能進一步提高。

a-柚皮納米纖維素1萬倍電鏡放大圖；b-柚皮納米纖維素10萬倍電鏡放大圖圖5 柚皮納米纖維素的場發射掃描電鏡圖Fig.5 SEM of NCC from pomelo’s mesocarp

2.4 紅外光譜分析結果

圖6 紅心柚皮微晶纖維素與納米纖維素的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of MCC and NCC from pomelo’smesocarp

2.5 X射線衍射分析

圖7為紅心柚皮微晶纖維素(MCC)與納米纖維素(NCC)的XRD圖，由圖7可以看出，MCC與NCC的衍射峰位置基本一致，均在衍射角2θ為15.08°、22.18°、34.62°處出現衍射峰，說明樣品晶型沒有發生改變，同時根據衍射峰存在的位置表明樣品的結晶類型屬于典型的纖維素Ⅰ型[28]，說明酸解反應沒有改變纖維素的結構，這與FTIR的結果一致。由Segal公式計算得出MCC與NCC的結晶度分別為44.72%和53.75%，NCC的結晶度增大，說明酸水解過程主要發生在MCC的無定形區，而結構致密的結晶區沒有受到較大程度的破壞，所以結晶區域的相對百分比增加，結晶度上升。

圖7 紅心柚皮微晶纖維素與納米纖維素的XRD圖Fig.7 XRD analysis of MCC and NCC in mesocarpof pomelo

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗分析，在料液比1∶10的條件下，篩選出制備柚皮納米纖維素的最優條件：H2SO4質量分數62%，反應溫度50℃，反應時間78 min，此條件下預測出的得率為63.86%，通過驗證試驗得到此條件下實際得率為63.27%，與預測值接近，說明建立的回歸模型良好可靠。由于單因素實驗中，反應時間為60 min與75 min時的得率無顯著性差異，考慮到實際生產的成本問題，可將反應時間縮短至60 min，以作為工業化生產的最適條件。由掃描電鏡結果得出，由MCC制備出的NCC粒徑減小至納米級(100～200 nm)，呈類球狀，大小分布均勻。紅外光譜和X射線衍射結果表明，制備出的NCC結構沒有發生改變，仍保持纖維素I型結構，結晶度53.75%，相較于MCC有明顯提高。綜上所述，在沒有破壞纖維素結構的基礎上，制備出的NCC比原料MCC具有更規則的結構、更大的比表面積和更高的結晶度，使柚皮纖維素具有更高的應用價值。同時NCC作為一種可生物降解的環保型材料，在食品包裝、增強復合材料、構建藥物載運體系等方面有巨大的潛力。較高的得率和穩定的晶型說明柚皮可以作為制備納米纖維素的良好來源，這不僅提高了柚皮的綜合利用，拓寬了柚皮纖維素的用途，也為納米纖維素的生產提供了新的來源。