一株具有益生特性的植物乳桿菌及其在發酵果蔬汁中的應用

朱珺，錢永清，孫盛，陳作國，陳蘇

(杭州娃哈哈科技有限公司，浙江 杭州，310018)

隨著人們生活水平提高與健康意識加強，通過飲食調整促進自身健康的觀念日益得到認同。乳酸菌發酵可賦予產品更為豐富的口感，同時賦予其更豐富的健康功能。近幾十年來，乳酸菌發酵飲品的消費量日益擴大，呈倍數增長[1]。乳酸菌發酵產品也不再限于發酵乳制品。發酵果蔬汁飲料概念自2014年提出后逐漸被行業所關注[2]。發酵后的果蔬汁相比一般果蔬汁具有更為豐富的營養和功能成分，如VC、VK、葉酸、β-胡蘿卜素、多酚類物質等[3-4]。乳酸菌作為人及動物腸道的益生菌，具有維持腸道生態平衡、提高機體免疫力等多種生理功能[5]。開發具有多種功能的乳酸菌發酵飲品，強化其保健作用將成為未來的發展方向[1]。同時，這對于可應用于果蔬汁發酵的成熟發酵劑產品也提出了更為迫切的需求。

乳酸菌本身的益生功能可為消費者提供更多的有益因素。隨著現代人飲食結構的變化、心理因素和社會因素的影響，便秘的發病率有增高趨勢。全球約16%的人群被功能性便秘困擾[6]。益生菌在發揮其潤腸通便等腸道調節功能時，相比其他藥物具有安全、無副作用等明顯優勢[7]。本研究從四川地區自然發酵的農家泡菜樣品中分離乳酸菌，篩選獲得1株同時具有良好植物基發酵性能與良好益生特性的菌株，為開發安全、有效且可應用于果蔬汁發酵的功能發酵劑產品提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

8株植物乳桿菌，植物乳桿菌553、557、566、573、578、581、590、596分離自四川甘孜藏族自治州、阿壩藏族羌族自治州、涼山彝族自治州等地區農戶采用傳統方法制作的自然發酵泡菜樣品。植物乳桿菌581(Lactobacillusplantarum581)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生物保藏號CGMCC No.13121。

1.2 儀器與材料

Type B2 Steril GARD Ⅲ生物安全柜，美國Baker公司； Delta 320 pH計，瑞士Mettler Toledo公司；5810 R離心機，日本Olympus株式會社；DNP-111電熱恒溫培養箱，上海海向儀器的設備廠。

MRS培養基，英國Oxoid生物試劑有限公司；牛膽鹽分析純試劑，廣州市金華大化學試劑有限公司；HT-29細胞株，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；ICR雄性SPF級小鼠，浙江省中醫藥大學動物試驗中心；麻仁丸，杭州胡慶余堂藥業有限公司；復方地芬諾酯，常州康普藥業有限公司；活性炭、阿拉伯樹膠，北京寶瑞杰科技有限公司。

紫薯汁、胡蘿卜汁、大蒜濃縮汁、姜汁，金鄉縣金得利食品有限公司；香蕉汁、芒果汁，山東佳美食品工業有限公司；蘆薈汁，云南萬綠生物股份有限公司。

1.3 菌株培養

于-80℃條件下冷凍保存的乳酸菌種子液，室溫解凍后，以2%接種比例接種于MRS液體培養基中，于37℃下培養16 h，連續活化2代。

1.4 耐酸性試驗

植物乳桿菌581菌株培養至對數末期后，取適量菌液。4 000 r/min離心10 min后，棄上清，分別加入pH值為2.0和2.5的MRS液體培養基，37℃培養，于0、1、2、4 h后采用平板計數法測定其活菌數，每組3次平行。

1.5 耐膽鹽試驗

植物乳桿菌581菌株培養至對數末期后，取適量菌液。4 000 r/min離心10 min后，棄上清，分別加入含有0.3%和0.6%(質量分數)膽鹽的MRS液體培養基，37 ℃培養，于0、4、8 h后用平板計數法測定其活菌數，每組3次平行。

1.6 通便功能評價試驗

1.6.1 動物飼養與分組

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》2003版中通便功能檢驗方法[8]。

試驗動物選擇6周齡ICR雄性小鼠220只。動物飼養保持環境溫度為(21±2)℃，濕度為 30%～70%，12 h光照交替，自由飲水，自由攝入小鼠維持飼料。試驗小鼠自購入起適應1周后，按體重進行隨機分組。排便試驗與小腸運動性試驗各分為11組，每組10只。

11組包括陰性對照組、模型組、陽性對照組與8組給藥組。8組給藥組分別灌胃植物乳桿菌581、553、557、566、573、578、590、596。分別制備上述8株植物乳桿菌菌株的冷凍干燥菌粉，采用平板培養法對凍干菌粉進行活菌計數。取一定量菌粉，重懸于無菌生理鹽水，用于小鼠灌胃。菌粉給藥劑量為3×109CFU/kg小鼠體重。陽性對照組灌胃麻仁丸試液，灌胃劑量為2 g/kg小鼠體重。劑量換算依據如表1所示。陰性對照組與模型組分別灌胃等量的無菌生理鹽水。受試樣品連續給喂7 d。

表1 人體服用量與小鼠灌胃量換算Table 1 The dosage for human body and mice

注：#小鼠服用劑量按人體服用量10倍進行換算，正常人體體重按60 kg進行換算。

1.6.2 模型的建立

排便試驗組：第1組小鼠于受試樣品給喂7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h，模型組、陽性對照組與給藥組灌胃復方地芬諾酯懸液(10 mg/kg小鼠體重)進行造模，陰性對照組給予等量的蒸餾水。

小腸運動性試驗組：第2組小鼠于受試樣品給喂7 d后，禁食不禁水，模型組、陽性對照組與給藥組灌胃復方地芬諾酯懸液(5 mg/kg小鼠體重)進行造模，陰性對照組給予等量的蒸餾水。

1.6.3 指標的測量

排便試驗組：給予復方地芬諾酯0.5 h后，各組小鼠灌胃墨汁(含5%活性碳粉，10%阿拉伯樹膠)，觀察并記錄每只小鼠的首粒排黑便時間、6 h內排黑便的粒數及重量。

小腸運動性試驗組：給予復方地芬諾酯0.5 h后，灌胃墨汁，25 min后立即處死并打開腹腔，測量小腸總長度與墨汁推進長度，計算墨汁推進率(%)=墨汁推進長度(cm)/小腸總長度(cm)×100。

1.7 發酵果蔬汁試驗

分別取芒果汁、香蕉汁、紫薯汁、蘆薈汁、胡蘿卜汁、大蒜汁、姜汁，稀釋至Brix=12后，于95℃下滅菌5 min。待料液冷卻至30℃后，將植物乳桿菌581以0.002%(1.0×107CFU/mL)的添加量接種到發酵基料中，37℃下進行發酵。在發酵后16 h測定基料的pH變化與活菌數，對發酵后果蔬汁進行感官品嘗。

1.8 統計分析

試驗結果以“平均值±標準差”表示。顯著性分析采用SPSS 19.0軟件，利用單因素方差分析(ANOVA)兩兩比較中的Duncan法進行分析,以P<0.05作為差異具有統計學意義的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 耐酸性試驗

植物乳桿菌581的耐酸性結果如表2所示。經過4 h的孵育試驗，植物乳桿菌581在pH 2.5與pH 2.0的酸環境下都呈現了較強的耐酸性。在pH 2.5的條件下作用4 h后，581的活菌數降低(0.157±0.104)個數量級。當pH值下降到2.0時，581的活菌數在孵育4 h后降低(0.243±0.035)個數量級。食物在胃部停留的時間一般為2～4 h。人體胃液中的pH值因飲食不同波動較大，空腹或食用酸性食品時pH值最低可達到1.5時，食用堿性食物時pH可達4.0～5.0，通常pH值為3.0左右[9]。以上結果表明植物乳桿菌581具有良好的耐酸特性。

表2 植物乳桿菌 581對酸的耐受性Table 2 Acid-tolerance of L.plantarum 581

注：“—”表示無。

2.2 耐膽鹽試驗

由表3可知，植物乳桿菌 581 在0.3%(質量分數)膽鹽作用4 h后，菌數降低(0.994±0.168)個數量級。延長作用時間至8 h后，菌數降低(1.084±0.257)個數量級，仍在1個數量級左右。將膽鹽質量分數提升至0.6%后，植物乳桿菌581的菌數在4和8 h作用時間下分別降低(1.205±0.096)和(1.378±0.205)個數量級。延長作用時間和提升膽鹽濃度對 581菌數影響不大。人體內膽鹽質量分數一般在0.3%以下波動[10]，因此植物乳桿菌 581在體內環境下能更好的存活。

表3 植物乳桿菌581對膽鹽的耐受特性Table 3 Bile salt-tolerance of L.plantarum 581

注：—表示無。

2.3 通便功能評價試驗

2.3.1 排便試驗

試驗期間，各處理組小鼠均未出現不良癥狀。排便試驗結果如表4所示。與陰性對照組相比，模型組小鼠的首次排黑便時間顯著增加(P<0.01)，6 h排黑便粒數和排黑便質量均顯著降低(P<0.01)，表明使用復方地芬諾酯構建小鼠便秘模型成功。

與模型組相比，灌胃581菌株的小鼠首次排黑便時間(P<0.01)、 6 h排黑便粒數(P<0.01)和排黑便質量(P<0.01)均得到顯著改善。同樣分離自四川泡菜樣品的其余7株植物乳桿菌中，僅566和596菌株灌胃組小鼠的首次排便時間、 6 h排便粒數與排便質量顯著改善(P<0.05)，但效果均不及581菌株。同時，581菌株對首次排黑便時間(P<0.01)與6 h排黑便粒數(P<0.05)2項指標的改善效果也顯著優于陽性對照的麻仁丸藥物服用組。

表4 不同菌株對便秘小鼠各排便指標的影響Table 4 Effects of different strains of lactobacillus on defecation in constipation rice model

注：平均值±標準差。標注*表示與模型組相比具有顯著性差異，P<0.05；標注**表示與模型組相比具有極顯著性差異，P<0.01。

2.3.2 小腸運動性試驗

試驗期間，各處理組小鼠均未出現不良癥狀。小腸運動性試驗結果如表5所示。模型組小鼠的墨汁推進率與陰性對照組相比顯著降低(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，灌胃植物乳桿菌581可顯著提高小腸的墨汁推進率(P<0.01)，其作用效果與陽性對照組相當(P>0.05)。

表5 不同菌株對小鼠墨汁推進率的影響Table 5 Effects of different strains on the ink propelling rates in mice model

2.4 發酵果蔬汁試驗

植物乳桿菌581在多種果蔬汁中的發酵情況如表6所示。經581菌株發酵后，果蔬汁本身的體系與色澤無顯著影響，也未觀察到任何不良風味。在pH值較低的高酸性果汁體系中，581菌株也可以進行發酵。芒果汁發酵前pH=3.91，發酵后pH=3.28，發酵液中活菌數達1.57×109CFU/mL。對于胡蘿卜汁、大蒜汁、生姜汁，發酵后料液中原本帶有的生沖味道明顯減少，口感更加柔和綿厚，醇香可口。同時，發酵產生的乳酸以及其他風味物質也為多款果蔬汁增加了清新、酸爽的口感。

高的活菌數是益生菌發酵產品的品質標準之一。本研究中發現植物乳桿菌581在胡蘿卜汁中發酵活力最強，發酵后活菌數可達1.24×109CFU/mL。安興娟等[11]以胡蘿卜和枸杞為原料，經單因素試驗與正交優化，制作的發酵果蔬汁中最終活菌數為7.1×107CFU/mL?；罹鷶档母叩褪且嫔l揮益生功效的前提與基礎，但前期一些相關研究未關注發酵果蔬汁中的活菌數[12-13]。

表6 植物乳桿菌581在多種果蔬汁中的發酵情況Table 6 Use of L.plantarum 581 in fermented fruit and vegetable juice

3 結論與討論

乳酸菌的分離鑒定和篩選工作對選育優良菌株至關重要，乳酸菌對胃腸道環境是否具有耐受性、能否順利到達腸道是其發揮益生功能的前提條件[14-15]。植物乳桿菌581在pH=2.0酸環境下脅迫4 h后活菌數降低(0.243±0.035)個數量級，在0.3%(質量分數)膽鹽作用8 h后，活菌數降低(1.084±0.257)個數量級。呂源玲[16]從嬰兒糞便中篩選獲得的1株具有最強耐酸耐膽鹽能力的植物乳桿菌，在pH=3.0條件下1、2、3 h后的存活率分別為75%、64%、46%。便秘是由于腸道功能紊亂引起的慢性疾病，主要臨床癥狀有排便困難、排便頻率低、糞便干硬和延長腸道排空時間[17]。本研究表明，服用植物乳桿菌581可以縮短便秘小鼠的首次排便時間，增加小鼠的排便粒數、排便質量，并提高小鼠的小腸墨汁推進速率。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》，植物乳桿菌581具有潤腸通便的功能。研究同時比較了分離自四川泡菜樣品的8株植物乳桿菌，植物乳桿菌581菌株在通便功能評價中的各項指標均優于其他菌株，表明植物乳桿菌在發揮通便功能方面也表現出明顯的菌株特異性。

植物乳桿菌581在多種果蔬汁中均表現出良好的發酵性能，在胡蘿卜汁中發酵活力最強，發酵后活菌數可達1.24×109CFU/mL。根據動物試驗結果，服用14.5 mL胡蘿卜汁發酵液即可達到581菌株的有效劑量。胡蘿卜中含有豐富的膳食纖維。高昂等[18]利用擠壓噴霧技術從胡蘿卜中提取的可溶性膳食纖維占原料質量的27.3%。可溶性膳食纖維能通過增加糞便持水力發揮潤腸通便的功能，膳食纖維經乳酸菌分解利用，產生乙酸、丁酸、丙酸等代謝產物，能進一步刺激腸道蠕動[19]。張敏佳等[20]報道了發酵果蔬汁對功能性便秘與肥胖都具有改善作用。某些植物乳桿菌在發酵過程中還可提高游離酚、抗壞血酸的含量，增加果蔬汁的抗氧化能力[21-22]。后續將針對581菌株發酵果蔬汁的成分變化與益生功能做進一步研究。植物乳桿菌581具備潤腸通便的益生特性和良好的果蔬汁發酵性能，該菌株可用于功能性發酵果蔬汁產品的開發，在提供良好風味的同時為消費者提供更多的有益因素。