不同種類糖對酪蛋白糖基化接枝改性的影響

徐世濤，朱秋勁，胡穎，周國君，朱建榮

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學，貴州省農畜產品加工與貯藏重點實驗室，貴州 貴陽，550025)3(遵義醫科大學 公共衛生學院，貴州 遵義，563000) 4(貴陽三聯乳業有限公司，貴州 貴陽，550025)

酪蛋白(casein, Cas)在牛乳中占牛乳蛋白含量的80%，是一種全價蛋白質，具有較高的營養特性，含人體必需的8種氨基酸，是生物體氨基酸的優質供給源。同時，酪蛋白具備起泡性、乳化性及凝膠性等多種功能特性。隨著食品工業的發展及人們日益增長的需求，酪蛋白在食品工業的應用越發廣泛。然而，諸如溶解性差等缺點，卻成為影響酪蛋白推廣應用的短板[1]，因此，對酪蛋白進行改性的呼聲不斷。蛋白改性方法較多，如利用改變或修飾蛋白結構以改善或加強蛋白功能特性的蛋白質改性法[2-3]，應用廣泛且效果明顯的化學改性法[4]。而未添加任何化學物質的美拉德反應糖基化接枝改性蛋白質的方法，反應條件溫和安全，是一種綠色有效的蛋白質改性方法[5-6]，該方法基于Maillard反應機理，利用蛋白質分子的ε-氨基與糖的還原性末端羰基共價結合的羰氨縮合反應完成對蛋白質的改性[1]。

目前關于蛋白質糖基化改性的研究主要集中在植物性蛋白，如大豆蛋白[7]、小麥蛋白[8]、玉米蛋白[9-10]、花生蛋白[3]、大米蛋白[11]等蛋白與葡萄糖，麥芽糊精，葡聚糖等糖的糖基化改性研究。而利用糖基化改性動物蛋白的研究較少，少數對雞蛋蛋白、乳清蛋白和酪蛋白糖基化改性的研究，則集中在干法糖基化改性，并且都只針對某一種糖與蛋白質發生美拉德反應的改性研究，而關于不同聚合度及結構差異糖類對酪蛋白發生糖基化接枝改性影響的研究則未見報道。

研究表明，糖作為改性反應物，其聚合度及其結構差異會使糖基化反應活性存在差異[12]。因此，本實驗根據聚合度及結構差異選取8種代表性糖，通過分析其接枝及性能差異，探究不同種類糖對酪蛋白發生糖基化接枝改性的影響。從而為糖基化改性蛋白質方法中改性物的選擇提供一定的數據支撐，以便酪蛋白糖基化接枝改性工作能夠更好的開展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、β-環糊精、鄰苯二甲醛/OPA(CP)、卵磷脂、β-巰基乙醇(≥99.0%)，美國Sigma公司；葡萄糖(分析純)，成都金山化學試劑有限公司；麥芽糖(95%)、D-果糖(99%)，源葉生物公司；葡聚糖20 000/右旋糖酐(生物試劑)、葡聚糖40 000/右旋糖酐40(生物試劑)、十二烷基硫酸鈉、2-硫代巴比妥酸(生物試劑)，國藥集團化學試劑有限公司；乳糖，上海博微生物科技有限公司；麥芽糊精(食品級)，山東西王食品有限公司；大豆油(食品級)，合力超市；甲醇、HCl、FeCl2等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CP214電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；Seven2GoTMpH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH系列數顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；HJ-6A多頭磁力攪拌器，金壇市文華儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；XHF-DY高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；L5S紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；SB25-12DT超聲清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司；CTFD-12S冷凍干燥機，青島永合創信電子科技有限公司；酶標儀(SpectraMAX190)，美國Molecular Devices公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酪蛋白糖基化處理

準確稱取一定量酪蛋白于pH為7.4的緩沖溶液中攪拌2 h充分溶解，制備質量濃度為60 g/L的均一蛋白溶液，按照質量比為3∶2加入糖溶解混合后超聲20 min[13-14]。將體系置于90℃恒溫水浴鍋中加熱并攪拌反應180 min，結束后迅速冷卻至室溫終止反應，冷凍干燥得到酪蛋白糖基化改性產物待用。

1.3.2 接枝度測定

接枝度(degree of graft, DG)的測定采用OPA法[15]，精確稱取鄰苯二甲醛(O-Phthalaldehyde)40 mg于1 mL甲醇溶液中，充分溶解后加入2.5 mL 20%(質量分數)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sylfate)，25 mL 0.1 mol/L-1的硼砂溶液和100 μL的β-巰基乙醇混勻后用蒸餾水定容至50 mL的容量瓶中。測定時，取200 μL/mL質量濃度為3 g/L的樣品溶液于試管中加入4 mL OPA試劑，同時以蒸餾水代替樣品溶液作空白對照；充分混勻后放置35℃的恒溫水浴鍋中避光反應2 min后在340 nm下測定吸光值A340。分別測定酪蛋白與糖糖基化接枝前后的吸光度值分別為A0和At。測定時，以蒸餾水調零。按照公式(1)計算酪蛋白與糖的接枝度DG：

(1)

式中：DG，接枝度，%；A0，接枝前的吸光度值；At，接枝后的吸光度值。

1.3.3 褐變指數的測定

參照GU和PIRESTANI等的方法[16-17]略作調整，取反應后的樣品溶液1 mL，加入5 mL 1 g/L SDS稀釋液，混合均勻，在420 nm下測定吸光值A420，以稀釋液作為空白。通過測定美拉德糖基化反應產物在420 nm處的吸光度。測定時，以蒸餾水調零。以吸光度的大小反映美拉德糖基化反應的褐變程度。

1.3.4 抗脂質氧化能力測定

參照ZHANG等[18]的方法，精確稱取卵磷脂溶解于0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液中配制質量濃度為10 g/L的卵磷脂溶液，標記為LLS溶液。精確稱量三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)15 g、2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)0.37 g，溶解后加入濃HCl 2 mL，以蒸餾水定容至100 mL，標記為TCA/TBA/HCl。

測定時向試管中依次加入1 mL樣品溶液、1 mL LLS和1 mL 400 μmol/L的FeCl3，同時以蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，混勻后將體系置于37℃恒溫水浴中水浴60 min后加入2 mL TCA/TBA/HCl溶液混勻，煮沸15 min后取出迅速冷卻，將冷卻后的溶液于8 400 r/min離心10 min，取上清液于532 nm測定其吸光度，樣品組的吸光度記為AS,空白管的吸光度記為AC。測定時，以蒸餾水調零。抗脂質氧化能力I按公式(2)計算：

(2)

式中：I，抗脂質氧化能力，%；AS，樣品組的吸光度值；AC，空白組的吸光度值。

1.3.5 乳化活性及乳化穩定性測定

參照PEARCE的方法[19]，略有改動。將樣品0.6 g溶于15 mL濃度為0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液中,取6 mL于在試管中加入2 mL大豆油，使最終油相體積分數為25%，以10 000 r/min的高速剪切均質分散1 min，因蛋白質產生大量泡沫影響精準度，故分別于靜置1、3、6、10、15 min后從乳濁液底部吸取100 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液中，混勻后在500 nm處測定樣品吸光度值，以0.1%的SDS溶液作為空白組。測得吸光度分別記為A1、A3、A6、A10、A15。乳化活性用EAI來表示；乳化穩定性用乳化穩定指數ESI表示，分別如公式(3)、(4)計算：

(3)

式中：EAI，每克蛋白質的乳化面積，m2/g；T，2.303；A0，起始的吸光值；N，稀釋倍數，50；φ，體系中油相所占的體積分數，25%；C，蛋白質的濃度，g/mL；L，比色光徑，1 cm。

(4)

式中：ESI，乳化穩定性；A0，起始的吸光值；At，t時刻的吸光值；Δt，時間差。

1.4 數據統計與分析

實驗均同時設置3組平行，結果以均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析并進行Duncan多重比較，以顯著性水平為0.05進行差異顯著性分析，以Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同種類糖與酪蛋白糖基化接枝度的測定

根據檢測結果，經分析后對酪蛋白-葡萄糖共價接枝產物(Cas-Glc)、酪蛋白-D-果糖共價接枝產物(Cas-Fru)、酪蛋白-麥芽糊精共價接枝產物(Cas-Md)、酪蛋白-麥芽糖共價接枝產物(Cas-Mal)、酪蛋白-葡聚糖20 000共價接枝產物(Cas-Dex20 000)、酪蛋白-葡聚糖40 000共價接枝產物(Cas-Dex40 000)、酪蛋白-β-環糊精共價接枝產物(Cas-β-Cd)、酪蛋白-乳糖共價接枝產物(Cas-Lac)的接枝度進行表征，結果如圖1所示。

圖1 不同種類糖的酪蛋白糖基化產物接枝度Fig.1 Grafting degree of products glycosylation modifiedby casein with different kinds of sugar注：圖中標注不同小寫字母表示樣品間差異顯著(P<0.05)。下同。

相同糖基化接枝條件下，Cas-Glc的接枝度最高，達到(25.03±1.01)%，顯著高于其他7種糖(P<0.05)，其次是Cas-Mal、Cas-Dex20 000、Cas-Dex40 000，接枝度分別為(18.06±1.01)%、(15.27±1.06)%和(13.23±0.65)%；其中，Cas-Dex20 000的接枝度顯著高于Cas-Dex40 000 (P<0.05)。

在醛糖Mal和Glc中，Glc分子量最小，Cas-Dex20 000分子量小于Cas-Dex40 000，可見糖基化接枝度可能與糖的分子量大小密切相關，有研究報道物質的分子量較小，在溶液中的遷移速率更快[7, 20]。糖分子尺寸增大，還原性末端的親電性降低會減小蛋白糖基化速率和程度，因此，相同接枝條件和時間下，糖分子量越小，糖基化程度也就越完全，陳穎佳[12]等人的研究結果也很好的說明了這一點。然而，同屬于單糖的D-果糖卻未得到如上效果，推測出現這樣的原因很可能與其分子結構有關系，因葡萄糖有醛基(-CHO)屬醛糖，而D-果糖含有羰基(-CO-)屬酮糖，不同結構糖糖基化位點選擇不同則糖基化程度也會出現差異，這與施振華[21]等人的研究結果一致，醛糖的糖基化反應高于酮糖。

2.2 不同種類糖與酪蛋白糖基化接枝改性褐變指數測定

隨著美拉德糖基化接枝反應的進行，體系會發生一定的褐變。反應程度越大，褐變也將會隨之加重，褐變程度過高，會影響產物色澤，不利于產品的進一步應用。因此接枝進程的控制尤為重要，既要獲得盡可能高的接枝度，同時應最大限度地保證產品色澤。實驗酪蛋白加熱前后及與不同種類糖進行糖基化接枝改性后的指數變化結果如圖2所示。

圖2 不同種類糖的酪蛋白糖基化接枝改性產物褐變指數Fig.2 The browning of products glycosylation modifiedby casein with different kinds of sugar

結果顯示，酪蛋白加熱后(H-Cas)褐變指數顯著高于加熱前(NH-Cas)，可見在酪蛋白溶解-加熱這個過程其自身會發生一定程度的褐變。與H-Cas褐變指數相比，具有一定接枝度的Cas-Mal、Cas-Dex20 000、Cas-Dex40 000褐變指數相對較小且差異不顯著(P>0.05)。而具有最好接枝度的Cas-Glc與接枝度較低的Cas-β-Cd之間的褐變指數差異不顯著(P>0.05)，且顯著高于其他種類糖(P<0.05)，這可能與糖的種類有關。不同糖的分子質量、結構和性質也各有差異，如β-環糊精由7個D-吡喃葡萄糖基單位，以α-1，4-鍵組合的非還原性環狀多糖，微溶于冷水和乙醇，不具有還原性末端,而具有一定抗氧化性。由此可得Cas-Mal、Cas-Dex20 000和Cas-Dex40 000在一定程度上能夠滿足有一定接枝度且褐變指數較低的糖基化產物需求，加之其營養和功能特性，在食品中應用前景廣闊。

2.3 不同種類糖與酪蛋白糖基化接枝改性產物抗脂質氧化能力測定

卵磷脂常被用作細胞模型來研究體外脂質過氧化，是因為卵磷脂中的C-2位上的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的不飽和脂肪酸在鐵離子的催化下發生過氧化，因此建立以鐵離子誘發卵磷脂C-2位上的LDL和VLDL、過不飽和脂肪酸的氧化模型，用來評價糖基化產物的抗脂質氧化能力[22]。由圖3可知，酪蛋白與不同種類糖進行糖基化接枝所得產物，除Cas-Fru具有促進脂質氧化能力外，其他皆具有一定抗脂質氧化能力。

圖3 不同種類糖與酪蛋白糖基化改性產物的抗脂質氧化能力Fig.3 The anti-lipid oxidation ability of products glycosylation modified by casein with different kinds of sugar

這是由于果糖在體外比葡萄糖更具活性，能產生更高水平的自動氧化。這與SEMCHYSHYN等[23]的研究結果一致。Cas-Glc抗脂質氧化能力顯著低于其他糖類(P<0.05)，這可能與其分子質量較小、難以形成穩定的抗脂質氧化物質有關[20]。而分子質量較大的Cas-Dex20 000、Cas-Dex40 000、Cas-β-Cd、Cas-Md等的抗脂質氧化能力不存在顯著性差異(P>0.05)，且具有較強的抗脂質氧化能力。而接枝度較低的Cas-β-Cd因β-環糊精本身具有一定的抗氧化特性，而表現出較高抗脂質氧化能力。可見，糖基化產物能夠一定程度上抑制Fe2+引發的卵磷脂分散體系過氧化。

2.4 不同種類與酪蛋白糖基化接枝改性產物乳化活性及乳化穩定性測定

乳化活性指的是蛋白參與乳濁液形成的能力。乳化穩定性指的是乳濁液保持分散，保持在一定時間內沒有發生油脂上浮、聚沉或者絮凝的能力。在蛋白質糖基化接枝改性中，糖的種類，不但會影響糖基化反應的程度，還會影響糖基化產物的性能[11, 24]。酪蛋白與不同糖發生美拉德糖基化接枝的產物乳化活性及乳化穩定性情況及顯著性差異分析如表1和表2所示。

表1 酪蛋白與糖糖基化接枝改性產物靜置1～15min的乳化活性(EAI)的差異性分析Table 1 The difference analysis of emulsified active EAI between casein and glycosylation graft modified products for 1-15 min

注：結果表示為均值±標準差；同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表1可知，與H-Cas相比，酪蛋白糖基化接枝改性產物的乳化活性均得到不同程度的改善或提高。其中Cas-Dex40 000、Cas-Dex20 000和Cas-Mal，分別顯著(P<0.05)提高了52.05%、42.47%和30.14%。酪蛋白糖基化接枝處理能夠在一定程度上改善或提高其乳化活性，這可能是蛋白糖基化共價接枝后，引入多糖使其原有緊密的蛋白結構被不同程度破壞，同時引入了糖鏈上的親水基團，使蛋白溶解性增加[25]，蛋白能夠充分舒展開，暴露更多疏水基團，二級結構更加有序，在離子液體中具有更大的流體動力學半徑，能有效吸附到油—水界面，降低了界面張力,利于乳化活性提高[26-27]。而接枝度較高的Cas-Glc卻未見較好的乳化活性。這可能與糖自身性質和較大接枝度引入了更多親水基團，影響對油-水界面的平衡，從而使其乳化活性降低[28]等因素有關。

同時，隨靜置時間的延長，乳濁液乳化活性都出現不同程度的下降。在靜置15 min內H-Cas、Cas-β-Cd、Cas-Fru、Cas-Glc呈線性下降，擬合方程為：EAI=-0.023 4t+0.740 2(R2=0.934 6)，而其他糖類與酪蛋白糖基化產物呈現階段性、間歇式下降；直到靜置15min時，H-Cas、Cas-Glc、Cas-β-Cd、Cas-Md及Cas-Lac的乳化活性不存在顯著性差異(P>0.05)，相對其他較低。

表2 酪蛋白糖基化接枝改性產物在不同時間段的乳化穩定性情況Table 2 The emulsification stability of casein glycosylation graft modified products at different time periods

由表2知，酪蛋白糖基化產物乳濁液靜置15 min后，接枝產物乳化穩定性由高到低依次為Cas-Dex40 000、Cas-Dex20 000、Cas-Mal、Cas-Fru和Cas-Glc。其中Cas-Lac雖然有效提高了其乳化活性，但乳化穩定性卻有所下降，這與張亞婷[29]的研究結果一致。而分子質量較大的Cas-Dex40 000表現出良好的乳化活性及乳化穩定性。其乳化穩定性較H-Cas顯著提高了85.91%(P<0.05)，且顯著高于其他接枝產物(P<0.05)。蛋白糖基化接枝反應后能夠顯著提高乳化穩定性，主要是因為兩方面原因，一是因為糖類物質在油-水乳化體系中一定程度能夠增加水相的黏度[30]。另一個就是，蛋白表面共價接枝的糖分子的空間位阻作用會使乳化劑形成的保護膜厚度增加，從而有利于乳化體系的穩定性[31]。與酪蛋白糖基化接枝的葡聚糖分子量越大，越有利于提高空間位阻效應，故Cas-Dex40 000表現出良好的乳化活性及乳化穩定性。而分子質量較小的糖類較分子質量大的糖類乳化穩定性較低，這可能是因為其與酪蛋白糖基化不能夠提供足夠的穩定作用[32]。

3 結論

利用濕法糖基化的改性方法，將酪蛋白分別與不同聚合度和結構差異的葡萄糖、D-果糖、麥芽糖、葡聚糖20 000、葡聚糖40 000、乳糖、麥芽糊精、β-環糊精8種糖進行糖基化共價接枝改性，探究酪蛋白與糖共價接枝改性后各特征指標的變化情況。接枝度測定結果表明醛糖中分子量較小的葡萄糖與酪蛋白共價接枝度最高。酪蛋白糖基化接枝改性產物的抗脂質氧化能力檢測發現，接枝物Cas-Mal、Cas-Dex20 000和Cas-Dex40 000抗脂質氧化能力較好；乳化性及乳化穩定性考察發現，酪蛋白糖基化接枝改性后乳化活性得到不同程度提高，其中Cas-Dex40 000的乳化性較H-Cas顯著提高了85.91%(P<0.05)，顯著高于其他糖類接枝化產物。在靜置15 min內，H-Cas、Cas-β-Cd、Cas-Fru、Cas-Glc的乳化活性呈線性下降，擬合方程為：EAI=-0.023 4t+0.740 2(R2=0.934 6)。

綜上所述，在不同聚合度和結構差異糖中，分子質量較大的酪蛋白與葡聚糖20 000、葡聚糖40 000和麥芽糖美拉德糖基化共價接枝改性后具有一定的接枝度，且有良好的抗脂質氧化能力和乳化能力及乳化穩定性；在單糖中，屬醛糖的葡萄糖與酪蛋白接枝情況明顯優于屬酮糖的果糖。酪蛋白糖基化共價接枝改性條件要求不高，可操作性強。酪蛋白及麥芽糖的原料來源非常廣泛，并且具有特殊營養價值。實驗結果為糖基化改性蛋白質方法中原料糖的選擇和復配提供一定的數據支撐，以便酪蛋白糖基化接枝改性工作能夠更好的開展。同時對酪蛋白與糖的營養價值提升及在食品領域中的開發應用有積極的影響。