添加餐廚廢油脂培養酵母進行γ-癸內酯生物轉化

王榮霞，朱廷恒，汪琨

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)

γ-癸內酯(γ-decalactone，GDL)是一種天然存在于草莓、桃子等水果中的內酯類香料，具有較低的香氣閾值，是國際公認的安全的食品添加劑[1-2]。隨著對美味食品、飲料等消費的不斷增長，天然食品香料添加劑的需求不斷增加。

生物法生產的GDL與天然植物成分更接近，得到了高度的重視[3-4]。GDL的生物轉化是以脂肪酸和脂肪酸酯作為底物，利用微生物進行發酵轉化生產。微生物有解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[5-7]、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[8]、Lindnerasaturnus等[9]，這幾株菌GDL產量分別為：0.168～1.597、0.954、0.512 g/L,其中解脂耶氏酵母是生產GDL的最主要菌株。

目前報道的解脂耶氏酵母生產GDL都是利用完全培養基[10-11]，含酵母提取物(10 g/L)、葡萄糖(20 g/L)等，工業化生產的成本高。已報道的解脂耶氏酵母的不同菌株(又見解脂假絲酵母CandidalipolyticaCICC31223)[12-13]，產酶活性和GDL差別很大，有的菌株能分泌大量的脂酶和酯酶，可以分解利用脂類物質進行生長，但是不能轉化生產GDL。如果能夠利用廉價的脂類物質替代完全培養基中部分營養成分，利用不同酵母菌株進行分解，再利用產GDL的解脂耶氏酵母進行GDL轉化生產，則可以顯著降低工業化生產成本。

我國餐廚廢棄油脂的量十分巨大[14-15]，開發利用這種廢棄資源作為培養基成分進行酵母培養[16]并轉化生產GDL，是一種既經濟又環保的方法。利用不同菌株混菌發酵協同降解餐廚廢油脂，獲得一定生物量的解脂耶氏酵母再進行GDL的轉化生產，是一條很有生產應用潛力的途徑，迄今尚無相關報道。

GDL的生物轉化法是對前體物蓖麻油酸經β-氧化生成[17-18]。解脂耶氏酵母中酰基輔酶A氧化酶家族(pox1-6分別編碼Aox1-6)是催化GDL生成的限速酶。其中Aox2表現出長鏈特異性，Aox3是短鏈特異性[19]，增加pox2拷貝比敲除pox3更有利于GDL產量提高[20]。

本研究探索添加餐廚廢油脂替代培養基中部分葡萄糖和酵母提取物，利用不同菌株混合發酵協同降解油脂，獲得較多解脂耶氏酵母生物量后再進行GDL轉化。同時構建了過表達pox2基因的工程菌株并進行了轉化研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)G3菌株：本實驗室選育保存的菌株；解脂假絲酵母(C.lipolytica)CICC31223：購自工業微生物菌種保藏中心;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH 5α：本實驗室保存。

1.2 培養基

YPD培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，固體添加20g瓊脂。

轉化培養基(g/L)：蓖麻油酸60，吐溫-80 5，KH2PO40.55，Na2HPO40.31，無水MgSO40.16，pH自然。

混菌發酵培養基(g/L)：蓖麻油20，餐廚廢棄油脂40，吐溫-80 5，KH2PO40.55，Na2HPO40.31，無水MgSO40.16，pH自然。

以上所有培養基均121 ℃滅菌20 min。

擴大培養基M1～M6成分及含量如表1：

表1 培養基成分 單位：g/L

注：餐廚廢棄油脂由學校食堂廢棄油脂分離得到；“-”代表未添加。

1.3 酵母降解酯類及生物量測定

測定不同酵母菌株降解酯類的能力。酯和內酯在堿性條件下與羥胺反應生成異羥肟酸，在酸性條件下異羥肟酸又與Fe絡合生成的紫紅色絡合物在OD506 nm有吸收[21]。挑取酵母單菌落于5 mL YPD液體培養基，28 ℃振蕩(200 r/min)培養過夜；轉接至30mL液體YPD培養基中，28 ℃振蕩(200 r/min)培養12 h， 6 000 r/min，離心3 min,菌體沉淀用山梨醇緩沖液洗滌2次，將菌濃度調至OD600nm=1的菌懸液，以8%的接菌量接種至60 mL/500 mL的轉化培養基中。28 ℃ 200 r/min振蕩培養，每隔12 h取500 μL發酵液，6 000 r/min，離心3 min，上清液稀釋至1.5 mL后測酯含量，菌體沉淀用于測生物量。將1 mL 0.5 mol/L的鹽酸羥胺乙醇加入到試管中，再加300 μL 6 mol/L的NaOH，加入1.5 mL已稀釋的發酵上清液；劇烈振蕩100 s,加入500 μL 4 mol/L的HCl溶液；待溶液變澄清，繼續加入150 μL 5 g/L的FeCl3溶液顯色，酶標儀測定OD506 nm，每組3個平行樣。

分光光度計法測生物量：用1 mL 50%(體積分數)的乙醇懸浮菌體沉淀，6 000 r/min，離心3 min，去上清，重復洗滌1次，去離子水重懸浮。測OD600 nm。

1.4 GDL測定方法

1.4.1 樣品處理

取200 μL的發酵液，與200 μL 1 g/L的桃醛溶液和500 μL乙酸乙酯溶液混合，振蕩混勻，8 000 r/min,離心1 min，將200 μL上清液轉移至新的1.5 mL的離心管，精確地取1 μL進樣測GDL含量。

1.4.2 高效氣相色譜檢測條件

HP-INNOWAX毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱溫180 ℃保持10 min，載氣(N2)流速4.3 mL/min，進樣1 μL；FID檢測器溫度280℃；分流比10∶1。

1.5 過表達pox2基因的解脂耶氏酵母工程菌構建

1.5.1 工程菌構建及分子鑒定

為了構建解脂耶氏酵母酰基輔酶A氧化酶基因pox2過表達菌株，合成由解脂耶氏酵母組成型啟動子驅動的pox3U-P-hph-T-P-pox2-T-pox3D表達框。pox3U，pox3D分別位于pox3(Gen Bank accession AJ001301)上游1 840-2 261 bp和下游4 247-4 666 bp區域；P是解脂耶氏酵母胞外堿性蛋白酶基因組成型啟動子XPR2(Gen Bank accession KF975902)；hph是潮霉素抗性基因(Gen Bank accession MG680575)；pox2(Gen Bank accession AJ001300)。上述各片段組成的重組表達框通過化學合成并克隆到pUC57空載質粒上(常州基宇生物公司)，將質粒轉入大腸桿菌中擴大培養，提取質粒經雙酶切獲得該重組表達框片段，用酵母轉化試劑盒(Frozen-EZ Yeast Transformation ⅡTM)通過同源重組轉入到解脂耶氏酵母G3中，涂布在含有400 μg/mL潮霉素的平板上進行初篩，待長出單菌落，轉接至含有潮霉素的液體YPD中，28 ℃振蕩(200 r/min)培養48 h,提取酵母基因組，進行PCR鑒定，通過分子鑒定的轉化子，使用TAIL-PCR法[22-23]驗證插入位點。分子鑒定引物如表2。

1.5.2 酵母菌株GDL產量的測定

挑取酵母單菌落于5 mL液體YPD培養基，28 ℃振蕩(200 r/min)培養過夜；轉接至30 mL液體YPD培養基中，28 ℃振蕩(200 r/min)培養12 h， 6 000 r/min，3 min離心收集菌體，用山梨醇緩沖液洗滌2次菌體，將菌濃度調至OD600 nm=1的菌懸液，以8%的接菌量接種至30 mL/250 mL的含蓖麻油酸的轉化培養基中。28 ℃振蕩(200 r/min)培養72 h。利用高效氣相色譜檢測GDL的產量。

表2 引物列表Table 2 List of the primers

1.6 含餐廚廢油脂培養基酵母培養及混菌發酵條件的探索

1.6.1 餐廚廢油脂培養酵母菌株

挑取酵母單菌落，接種于5 mL的液體YPD培養基中，28 ℃振蕩(200 r/min)培養過夜；轉接至30 mL/250 mL擴大培養基中，培養12 h,培養條件同上，6 000 r/min,離心3 min，收集菌體，用山梨醇緩沖液洗滌菌體2次，將菌濃度調至OD600 nm=1的菌懸液，以1%的接菌量接種到30 mL/250 mL擴大培養基(M1～M6)中，28 ℃振蕩(200 r/min)培養12 h后，將菌液轉移到50 mL的離心管，6 000 r/min，3 min離心，棄上清，用無菌水洗滌3次菌體，使用分光光度法測生物量。以上每個試驗設置3個平行試驗，并重復3次。

1.6.2 混菌發酵轉化適宜條件的探索

1.6.2.1 混菌發酵轉化適宜的接種方式

將混菌發酵培養基以每瓶30 mL分裝于250 mL的錐形瓶中。將適宜擴大培養基培養得到的菌液，調整其濃度，調至OD600 nm=1的菌懸液，以總接種量為8%，分別按以下3種接種方式接入適宜比例的菌懸液。以等量的無菌生理鹽水代替菌懸液作空白對照，28 ℃振蕩(200 r/min)培養72 h，檢測GDL的產量。以上每個試驗設置3個平行試驗，并重復3次。

按種方式分為3種，分別為：A先接種解脂耶氏酵母菌株，12 h后再接種解脂假絲酵母菌株；B先接種解脂假絲酵母菌株，12 h后再接種解脂耶氏酵母菌株；C同時接種解脂耶氏酵母菌株，解脂假絲酵母菌株。

1.6.2.2 混菌發酵轉化適宜的接種比例

將混菌發酵培養基以每瓶30 mL分裝于250 mL的錐形瓶中。將適宜擴大培養基培養得到的菌液，調整其濃度，調至OD600 nm=1的菌懸液，以總接種量為8%(分別以V(C.lipolytica)∶V(YL-pox2-12)=1∶10，1∶20、1∶30的比例接入菌液，以等量的無菌生理鹽水代替菌懸液作空白對照，28℃振蕩(200 r/min)培養72 h，檢測GDL的產量。以上每個試驗設置3個平行試驗，并重復3次。

2 結果與分析

2.1 酵母降解酯類及生物量測定

為了觀察解脂耶氏酵母G3與解脂假絲酵母CICC31223轉化培養基中酯含量的變化，將2種菌株以相同濃度，接種到相同培養基中，每隔12 h取樣測總酯含量。結果發現解脂假絲酵母處理后總酯含量呈下降趨勢，而解脂耶氏酵母總酯含量基本不變，說明解脂假絲酵母能夠更好地利用油脂(圖1)，但是該菌株GDL產量很低(結果見下文)。生物量測定結果表明，24 h之前，2株菌的生長速率相同，但是在24 h之后解脂耶氏酵母的生長速率較低(圖2)，可能是因為解脂耶氏酵母細胞生長受到發酵過程產生的內酯抑制。

圖1 轉化過程中總酯的變化Fig.1 Changes in total ester during conversion

圖2 轉化培養基中酵母菌株生物量的變化Fig.2 Growth of yeast strain in the fermentation medium

2.2 基因工程菌株的構建

2.2.1 基因工程菌的分子鑒定

構建過表達GDL合成的限速酶酰基輔酶A氧化酶pox2基因的解脂耶氏酵母基因工程菌，獲得259株轉化子，提取轉化子基因組，利用引物對F1/R1通過PCR擴增潮霉素基因片段，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小與預期相符圖3-a。經分子鑒定獲得5個解脂耶氏酵母基因工程菌株，編號YL-pox2-10、YL-pox2-11、YL-pox2-12、YL-pox2-13、YL-pox2-136。為了驗證轉化子同源重組片段的插入位點，利用TAIL-PCR進行鑒定。設計3個特異性嵌套引物與5個簡并引物，引物序列(表2)，進行3輪PCR，YL-pox2-12工程菌株的TAIL-PCR凝膠電泳結果圖3-b，所得到的目的條帶切膠回收、測序。結果表明成功構建了解脂耶氏酵母pox2基因過表達菌株。

a-F1/R1引物；b-YL-pox2-12 TAIL-PCR驗證結果圖3 轉化子驗證Fig.3 Transformants validation注：a圖中：M-Marker；1、2-以野生型基因組為模板的陰性對照；3～7-轉化子；b圖中1、4、7、10、13-特異性引物SP1分別與簡并引物LAD1-LAD5的擴增結果；2、5、8、11、14-特異性引物SP2分別與簡并引物LAD1-LAD5的擴增結果；3、6、9、12、15-特異性引物SP3分別與簡并引物LAD1-LAD5的擴增結果。

2.2.2 酵母菌株單菌發酵轉化生產γ-癸內酯的結果

對Y.lipolyticaG3、C.lipolyticaCICC31223菌株以及獲得的5株解脂耶氏酵母pox2基因過表達工程菌，以蓖麻油酸作為底物，進行單菌發酵轉化生產GDL的研究。工程菌YL-pox2-10、YL-pox2-11、YL-pox2-12、YL-pox2-13、YL-pox2-136的GDL產量均比出發菌株高，其中YL-pox2-12產量最高，達1.5 g/L，較出發菌株GDL產量提高了2.2倍，差異顯著(P<0.05)(圖4)，結果表明pox2基因的過表達能顯著提高GDL轉化，顯示出該基因的應用潛力。

2.3 解脂耶氏酵母培養條件與混合菌株發酵的適宜條件

2.3.1 通過添加餐廚廢棄油脂培養解脂耶氏酵母

為了降低工業化生產GDL的成本以及廢物再利用，用餐廚廢棄油脂代替完全培養基中的部分葡萄糖和酵母提取物，在不同營養物培養基中培養12 h后，觀察酵母積累的變化情況。M6為完全培養基，M4中不含葡萄糖。將M6中的葡萄糖從20 g/L降到12.5 g/L，酵母提取物從10 g/L降到5 g/L得到培養基(M5)，此時培養酵母生物量為1.02，比M6中略低。在M5的基礎上，添加不同濃度的餐廚廢棄油脂(餐廚廢棄油脂含量M3

圖4 酵母菌株轉化蓖麻油酸生產γ-癸內酯Fig.4 Yeast strain transforming ricinoleic acid intoγ-decalactone注：WT-Y.lipolytica G3；CL-C.lipolytica；10-YL-pox2-10；11-YL-pox2-11；12-YL-pox2-12；13-YL-pox2-13；136-YL-pox2-136，是Y.lipolytica過表達pox2基因得到的基因工程菌。*代表差異顯著(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.05)。下同。

圖5 不同培養基對酵母生長的影響Fig.5 Effect of different media on yeast growth

2.3.2 不同酵母菌株的最適接種方式

為了提高解脂耶氏酵母和解脂假絲酵母混菌發酵GDL產量，研究了2株酵母的接種方式。使用混菌發酵轉化培養基，以餐廚廢棄油脂代替部分葡萄糖、酵母提取物，蓖麻油作為底物，試驗設計了A、B、C三種不同的接種方式，結果表明B為最適的接種方式，即先接種解脂假絲酵母，12 h后再接種解脂耶氏酵母YL-pox2-12，能將油脂降解成能被YL-pox2-12利用的脂肪酸，將其轉化為GDL，B的GDL產量顯著高于其他2種方式(P<0.05)。當同時接種或先接種YL-pox2-12時，轉化生產GDL的產量基本相同(圖6)。

圖6 不同接種方式對混菌發酵生產γ-癸內酯的影響Fig.6 Effect of different inoculation methods on theproduction of γ-decalactone by mixed fermentation

2.3.3 混菌發酵轉化蓖麻油生產GDL適宜接種比例的確定

研究表明不同解脂耶氏酵母菌株產生的脂肪酶活性不同，可應用于食品、油脂等工業化生產，但有的不能轉化生產GDL[13]。為了充分利用2株酵母各自的優勢，將高產GDL工程菌株YL-pox2-12和解脂假絲酵母CICC31223進行混菌培養，通過餐廚廢油脂的高效利用，產生生物量較多的解脂耶氏酵母再進行GDL轉化。在含餐廚廢棄油脂和蓖麻油兩種碳源的發酵培養基中，利用混合菌株發酵生產GDL。設置了2種菌3個不同比例的試驗梯度,相同菌體濃度的解脂假絲酵母和解脂耶氏酵母菌液體積比為 1∶5、1∶10、1∶20，進行同時接種。結果發現當接菌比例為1∶10時，為最適接種比例，轉化廢油脂生成GDL的產量為0.15 g/L，而工程菌株YL-pox2-12單獨在該發酵轉化培養基中的生成GDL的產量為0.08 g/L。因此，混菌發酵效果比單菌好，對混菌比例進行差異顯著性分析，1∶5與1∶10這兩種比例在P值為0.05水平上,差異顯著(圖7)。結果表明解脂假絲酵母CICC31223能提高底物廢棄油脂的分解效率，也獲得了足夠量的解脂耶氏酵母生物量進行GDL轉化。

圖7 不同接種比例對混菌發酵生產γ-癸內酯的影響Fig.7 Effect of different inoculation ratios on the productionof γ-decalactone by mixed fermentation

3 結論

微生物轉化法生產天然GDL面臨的主要問題是工業化生產的成本高。這可以通過開發廉價的微生物發酵原料、菌種改造、改進發酵及轉化工藝等方面進行改善。

本研究探索利用餐廚廢棄油脂作為部分碳源，成功培養解脂耶氏酵母菌株并進行GDL轉化生產。采用混合菌株發酵有效利用廢棄油脂作為微生物生長的碳源，并轉化生產GDL。初步發現混菌發酵的最適條件為：解脂假絲酵母G3∶解脂耶氏酵母CICC31223為1∶10，先接種解脂假絲酵母菌株培養12 h后再接種解脂耶氏酵母。本研究獲得pox2基因過表達的解脂耶氏酵母工程菌株YL-pox2-12，搖瓶發酵轉化生產GDL產量達 1.5 g/L，是原始菌株的2.2倍，顯示出良好的應用前景。