牡蠣酶解液-葡萄糖美拉德反應(yīng)前后體系的溶解特性及氨基酸組成分析

裴繼偉，丁連坤，李麗，昝立婷，齊晴，劉海梅，趙芹

(魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái)，264025)

美拉德反應(yīng)是還原糖和氨基化合物如氨基酸、胺、肽和蛋白質(zhì)之間的發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)，廣泛發(fā)生在食品加工與貯藏過程中，對(duì)加工食品風(fēng)味物質(zhì)的形成有重要貢獻(xiàn)[1-6]。除了以模式反應(yīng)體系研究美拉德反應(yīng)途徑和風(fēng)味化合物形成機(jī)理外，眾多研究者利用食品體系中本身存在的大量氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和蛋白水解物來制備各種風(fēng)味的調(diào)味料，其中蛋白水解物是主要的氨基化合物來源[7-16]。在美拉德反應(yīng)中，pH是影響反應(yīng)的重要因素之一，不僅影響美拉德反應(yīng)途徑和反應(yīng)效率，也會(huì)影響蛋白水解物的溶解性。另外，大部分的美拉德反應(yīng)是在水系中完成的，反應(yīng)所形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)也主要應(yīng)用于水系中，因此，蛋白水解物和MRPs在一定pH范圍內(nèi)必須具有良好的水溶解性。

在利用美拉德反應(yīng)生產(chǎn)風(fēng)味調(diào)味料時(shí)，蛋白水解物具有重要的作用，一是作為前體物質(zhì)參與美拉德反應(yīng)，形成風(fēng)味物質(zhì)，二是小肽和氨基酸作為風(fēng)味增效劑，提供MRPs特有的滋味[17-22]。而游離氨基酸和肽中的氨基酸具有不同的美拉德反應(yīng)活性[4]，參與反應(yīng)的氨基酸種類和數(shù)量不同，對(duì)MRPs風(fēng)味的貢獻(xiàn)也不同。

因此，本課題擬以牡蠣酶解液(oyster enzymatic hydrolysate，OEH)作為美拉德反應(yīng)的氨基化合物，與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，研究美拉德反應(yīng)前后溶液溶解特性及氨基酸組成的變化，探討美拉德反應(yīng)中OEH中以不同形式存在的氨基酸的美拉德反應(yīng)活性，為OEH和MRPs在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣(Crassostreagigas):煙臺(tái)振華量販魯東大學(xué)店；Protemax復(fù)合蛋白酶(酶活力 1.5 AU/g)：諾維信憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技(北京)有限公司；葡萄糖：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；D-(+)-核糖、D-(+)-木糖：上海市藍(lán)季生物有限公司；二甲基硅油：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SH220石墨消解爐、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀、HD4020凱氏定氮滴定系統(tǒng)，濟(jì)南海能儀器有限公司；DF-2集熱式恒溫磁力攪拌器(油浴鍋)，金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；JJ-2B組織勻漿搗碎機(jī)，金壇市榮華儀器制造有限公司；PB-10普及型pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OEH的制備

按照劉海梅等[23]的方法，將復(fù)合蛋白酶按30 AU/kg的加酶量加入牡蠣肉勻漿(牡蠣肉與水按質(zhì)量比1∶5混合搗碎)中，在自然pH下，于50 ℃下恒溫酶解4 h，置于100 ℃沸水中滅酶15 min，酶解產(chǎn)物于5 000 r/min下離心15 min，所得上清液即為OEH。

1.3.2 粗蛋白含量的測(cè)定

采用GB/T 6432—2018[24]凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 MRPs的制備

按照劉海梅等[23]的方法，OEH中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的葡萄糖，在pH 7.0下，于110 ℃下加熱90 min，冷卻至室溫，即為MRPs。

1.3.4 氮溶解指數(shù)(nitrogen solublility index，NSI)的測(cè)定

按照ADLER-NISSEN等[25]的方法，取一定量的樣液，用1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至所需pH，靜置20 min后離心(4 000 r/min，20 min)，測(cè)定上清液中總氮含量。按公式(1)計(jì)算，得到NSI值。

(1)

式中：N1，上清液中總氮量，g；N2，樣液中總氮量，g。

1.3.5 三氯乙酸-氮溶解指數(shù)(trichloroacetic-nitrogen solublility index，TCA-NSI)的測(cè)定

按照譚斌等[26]的方法，取10 mL樣液，與等體積的 20% TCA溶液混合，振蕩均勻，靜置 20 min，于4 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定總氮量，則TCA-NSI值按公式(2)計(jì)算。

(2)

式中：N1，上清液中總氮量，g；N0，樣液中總氮量，g。

1.3.6 游離氨基酸的制備

按照LAN等[6]的方法，20% TCA溶液與樣液等體積混合振蕩，沉淀肽或蛋白質(zhì)，于室溫下靜置2 h，5 000 r/min下離心30 min，離心所得上清液即為游離氨基酸樣液。

1.3.7 氨基酸組成的測(cè)定

樣品用6 mol/L HCl或4.2 mol/L NaOH在110 ℃水解24 h，進(jìn)樣量20 μL，流速0.4 mL/min，在570、440 nm下用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 OEH的溶解特性分析

2.1.1 NSI測(cè)定

分別測(cè)定OEH在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0下的含氮量，計(jì)算NSI值，結(jié)果見圖1。

圖1 不同pH下OEH的氮溶解指數(shù)Fig.1 The nitrogen dissolution index of OEH in different pHs注：不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。下同

由圖1可知，在不同pH下，OEH溶解性不同，NSI在pH 3.5～9.0呈先降低后增加又降低的趨勢(shì)，在pH 5.0時(shí)達(dá)到最低值83.89%。牡蠣蛋白的等電點(diǎn)在pH 5.0附近[27]，在pH 5.0時(shí)較低的NSI也表明此點(diǎn)是OEH的等電點(diǎn)，溶解度最小。在pH<等電點(diǎn)5.0時(shí)，pH值越小，NSI值越大，即其溶解度越大；pH>等電點(diǎn)5.0時(shí)，隨著pH的升高其溶解度也顯著增高(P<0.05)，說明pH越遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，OEH的溶解性越好。在食品pH 4.0～7.0，OEH的NSI值在83.89%～90.73%，OEH具有較高的溶解性，適宜在食品體系中添加使用。在所測(cè)pH范圍內(nèi)，NSI均>83.89%，也適宜應(yīng)用于美拉德反應(yīng)中。

2.1.2 TCA-NSI測(cè)定

測(cè)得OEH的TCA-NSI為86.40%，說明OEH中蛋白質(zhì)主要以小分子肽和氨基酸的形式存在，但仍然存在13.6%的大分子肽。

2.2 MRPs的溶解特性分析

2.2.1 NSI測(cè)定

分別測(cè)定MRPs在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0下的含氮量，計(jì)算NSI值，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在等電點(diǎn) 5.0 附近，MRPs具有最小NSI值，為91.76%，此時(shí)溶解度最小。pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，NSI顯著提高(P<0.05)，pH值為9.0時(shí)，NSI為98.55%，達(dá)到最高值。在整個(gè)pH范圍內(nèi)，NSI在91.76%～98.55%，比OEH高出約10%。這說明OEH經(jīng)美拉德反應(yīng)后，溶解性顯著變大(P<0.05)，MRPs比OEH更適宜添加到食品體系中。

圖2 不同pH下MRPs的氮溶解指數(shù)Fig.2 The nitrogen solubility index of Maillard reactionproducts in different pHs

2.2.2 TCA-NSI測(cè)定

MRPs的TCA-NSI為94.73%，顯著高于OEH(P<0.05)，說明MRPs中大分子肽的含量少于OEH，MRPs中有94.73%蛋白質(zhì)以游離氨基酸和小分子肽形式存在，僅有5.27%以大分子肽形式存在。對(duì)比OEH的TCA-NSI，MRPs的溶解性顯著高于OEH的溶解性，可能與大分子肽的含量有關(guān)，大分子肽的溶解性易受pH的影響，當(dāng)體系中電荷改變時(shí)，大分子肽會(huì)因靜電相互作用發(fā)生聚集或排斥，改變其溶解性。

2.3 粗蛋白含量的分析

分別測(cè)定OEH、MRPs中的粗蛋白含量，結(jié)果見表1。

表1 粗蛋白含量Table 1 Crude protein content

由表1可知，OEH的粗蛋白含量為1.45%，經(jīng)美拉德反應(yīng)后，MRPs中粗蛋白含量減少20.69%，可能是OEH中的肽、游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)[5-6，28-29]，生成了大量含氮的揮發(fā)性化合物，從溶液中揮發(fā)出來，導(dǎo)致溶液中含氮量的減少，粗蛋白含量降低。

2.4 美拉德反應(yīng)前后氨基酸組成變化

2.4.1 總氨基酸組成變化

在OEH和MRPs中氨基酸主要以游離氨基酸和小肽的形式存在，測(cè)定美拉德反應(yīng)前后總氨基酸含量的變化，見表2。

表2 總氨基酸組成變化Table 2 The change of total amino acids composition

由表2可知，OEH與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，除Cys含量有少量增加外，其他氨基酸和總氨基酸含量均降低，與OEH相比，MRPs中總氨基酸含量降低了13.50%，這與粗蛋白含量的變化結(jié)果一致(表1)，說明在美拉德反應(yīng)過程中部分氨基酸作為美拉德前體物質(zhì)參與了反應(yīng)，引起其含量的降低。美拉德反應(yīng)活性最高的是Arg，有22.08%參與了美拉德反應(yīng)，其次為Trp，有21.00%參與了反應(yīng)，His、Tyr、Gly、Lys、Thr、Ser、Ala等8種氨基酸參與美拉德反應(yīng)比例15%～19%，Asp、Glu、Leu、Ile、Val、Pro等6種氨基酸參與美拉德反應(yīng)的比例為10%～15%，而Phe、Met參與程度較低。由此可見，Arg、Trp、His、Tyr、Gly、Lys、Thr、Ser、Ala等10種氨基酸的美拉德反應(yīng)較強(qiáng)，是參與美拉德反應(yīng)的主要氨基酸組成。其中Arg、Trp、His這3種氨基酸為苦味氨基酸[20]，它們的減少可以減弱美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的苦味。

2.4.2 游離氨基酸組成變化

由表3可知，經(jīng)TCA沉淀后，OEH和MRPs中的氨基酸含量大幅度下降，分別減少了43.68%、41.19%，游離氨基酸含量分別占樣液總氨基酸的56.32%、58.81%，說明總氨基酸中以游離氨基酸為主，肽含量次之。經(jīng)美拉德反應(yīng)后，游離氨基酸含量減少了55.033 mg/100 mL，減少比例達(dá)9.68%，低于總氨基酸的減少比例(13.50%)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，游離氨基酸含量減少的現(xiàn)象與LAN等[6]的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)木糖和大豆蛋白肽體系在不同溫度下的美拉德反應(yīng)過程中游離氨基酸總量均降低，且隨溫度的升高降低幅度不斷增加。在總氨基酸(表2)中包含游離氨基酸和肽兩部分，從游離氨基酸和總氨基酸的減少比例不同來看，說明肽和游離氨基酸均參與了美拉德反應(yīng)，為美拉德反應(yīng)的重要氨基化合物。游離氨基酸是美拉德反應(yīng)的重要氨基化合物，小分子肽是美拉德反應(yīng)的另一重要氨基化合物，趙謀明等[31]發(fā)現(xiàn)小分子寡肽具有較高的美拉德反應(yīng)活性。

在所有游離氨基酸中，Val、Ala、Leu、Gly、His、Arg這6種氨基酸的美拉德反應(yīng)活性較高，參與比例在15%以上，其中Val減少比例最高，達(dá)到25.83%；其次是Asp、Lys、Ile、Glu、Thr，參與比例在10%以上，低于10%的是Ser、Trp、Met和Phe這4種氨基酸。另外，Cys、Pro、Tyr含量出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。可見，Val、Ala、Leu、Gly、His、Arg這6種氨基酸是參與美拉德反應(yīng)的主要游離氨基酸種類。

表3 游離氨基酸組成變化Table 3 The change of free amino acids composition

2.4.3 肽組成變化

根據(jù)美拉德反應(yīng)前后總氨基酸和游離氨基酸含量變化，計(jì)算反應(yīng)前后以肽形式存在的氨基酸含量，結(jié)果見表4。

表4 肽中氨基酸組成變化Table 4 The change of amino acids composition in peptides

由表4可知，OEH與MRPs中以肽形式存在的氨基酸分別占總氨基酸的比例為43.68%、41.19%，說明OEH和MRPs中以肽形式存在的氨基酸含量低于游離氨基酸的。OEH與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，以肽形式存在的氨基酸含量降低了18.43%，除了Cys、Val、Phe含量增加外，其他氨基酸含量均減少，說明在美拉德反應(yīng)過程中，肽作為美拉德前體物質(zhì)參與了美拉德反應(yīng)，且以肽的形式參與美拉德反應(yīng)的程度高于游離氨基酸的。不同分子質(zhì)量肽具有不同的美拉德反應(yīng)活性，寡肽的反應(yīng)活性高于大分子多肽[29]，LAN等[6]也認(rèn)為分子質(zhì)量低于1 000 Da的小肽比高分子量肽的美拉德反應(yīng)活性強(qiáng)，當(dāng)美拉德反應(yīng)不斷消耗游離氨基酸后，打破了肽和游離氨基酸之間的平衡，肽會(huì)向熱降解方向進(jìn)行，從而引發(fā)1 000 Da以下小肽的降解。另外，OEH-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系是在110 ℃的高溫下進(jìn)行的，LAN等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于100 ℃以后，5 000 Da以上分子質(zhì)量肽會(huì)產(chǎn)生熱降解反應(yīng)，因此，此美拉德反應(yīng)體系中，大分子質(zhì)量肽也會(huì)在110 ℃的高溫下發(fā)生熱降解反應(yīng)。這些肽降解方式，均會(huì)導(dǎo)致體系中游離氨基酸和寡肽或小分子肽的生成，從而給予美拉德反應(yīng)充分的游離氨基酸和寡肽進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

在所有以肽形式存在的氨基酸中，Tyr降低比例最高，為79.86%，是美拉德反應(yīng)活性最高的氨基酸，其次是Arg、Trp、Ser、His、Pro、Lys6種氨基酸，降低比例20%～30%，Thr、Glu、Gly、Asp、Ile等5種氨基酸的降低比例在13%～20%，而Ala、Leu、Met降低比例在10%以下。而Cys和Val含量出現(xiàn)增加現(xiàn)象。在美拉德反應(yīng)過程中，不僅會(huì)發(fā)生肽的熱降解，游離氨基酸和大分子肽(分子質(zhì)量1 000～5 000 Da和5 000 Da以上的)也會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[6]，兩種氨基酸含量增加可能是由于游離氨基酸或肽交聯(lián)形成更高分子量的新肽而引起的。在游離氨基酸(表3)中，Val含量降低幅度最大，減少了25.83%，而在肽(表4)中，Val含量的增加幅度最大，此現(xiàn)象也說明Val參與了肽的形成。Tyr在肽中含量降低幅度最大，而在游離氨基酸中其含量增加幅度最大，說明含Tyr的肽發(fā)生了熱降解反應(yīng)，生成了游離Tyr。Pro在肽中的含量下降了20.79%，而在游離氨基酸中含量增加了2.12%，也說明含Pro的肽發(fā)生了部分降解，生成了少量的游離Pro。

3 結(jié)論

OEH與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，所生成的MRPs溶解特性和氨基酸組成發(fā)生了明顯的變化。MRPs的溶解特性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于OEH，OEH的NSI值在85.43%～88.54%，TCA-NSI值為86.40%，而MRPs的NSI值在95.15%～98.08%，TCA-NSI值為94.73%，在美拉德反應(yīng)過程中，大分子肽發(fā)生了熱降解，形成了含有94.73%游離氨基酸和小分子肽的蛋白質(zhì)存在形式。OEH中的游離氨基酸和小分子肽均參與了美拉德反應(yīng)，但是它們的美拉德反應(yīng)活性不同，小分子肽的美拉德反應(yīng)活性高于游離氨基酸的，且以不同形式存在的氨基酸參與美拉德反應(yīng)的主要氨基酸種類存在差異。在OEH-葡萄糖的美拉德反應(yīng)過程中，不僅發(fā)生了大分子肽的熱降解，同時(shí)也形成了新的肽。