響應面法優化藜麥種子黃酮的超聲波輔助提取工藝

吳雅露，陳琪，陳夢濤，應鵬飛，蔣玉蓉，陸國權

（浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江杭州311300）

藜麥（Chenopodium quinoa Wild.），又稱南美藜、藜谷等，是一種一年生的藜科草本作物[1]。它是聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）推薦的唯一的單體植物就可以滿足人體全部基本物質需求的完美全營養食品[2]，其蛋白質含量很高，富含不飽和脂肪酸、類黃酮等多種有益化合物，被譽為“糧食之母”、“未來的超級谷物”、“營養黃金”、“有機谷類之王”等[3-4]。黃酮類化合物是植物中重要的次生代謝產物之一，是一種生理活性活潑的物質，具有抗病毒、抗癌防癌、防治動脈粥硬化、降血壓、血脂及膽固醇等藥理作用[5-7]，其中對糖尿病的治療效果明顯[8]。然而目前有關藜麥種子黃酮類化合物的研究報道尚少。

藜麥種子黃酮具有較強的清除自由基、抗氧化等功效[9]，研究與開發前景廣闊。目前關于藜麥種子黃酮的提取方法有乙醇回流提取[10-11]、超聲輔助提取[12-13]、微波輔助提取[14-16]等。響應面方法是通過部分因子試驗找出重要因子，然后應用最陡爬坡路徑方法逼近最大響應面區域，最后通過中心組合設計試驗找到最優組合[17]。與傳統的直線回歸分析方法相比，它具有分析多因素的能力；與正交試驗設計方法相比，它能找到試驗設定值之間的最佳組合[18]。本研究采用響應面分析法[19-21]，在提取時間、超聲功率、提取溫度3 個單因素試驗的基礎上，以總黃酮得率為評價指標，對超聲波輔助提取藜麥種子總黃酮的工藝進行優化，并與乙醇熱回流工藝比較，為藜麥黃酮類物質的開發利用提供理論依據。探索最佳提取工藝條件和最佳純化工藝條件，進而提高黃酮產量，為多種疾病的治療與預防提供一定的物質保障。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

藜麥Temuco 品種干燥種子：浙江農林大學提供，粉碎機充分粉碎，過0.5 mm 孔篩篩選，裝入干燥器皿中備用。

蘆丁對照品：國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇：均為國產分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器和設備

TP-214 電子天平：丹佛儀器有限公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋：上海申勝生物技術有限公司；TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；752PC 紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；JAC-600 超聲波中藥處理機：山東濟寧超聲電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮的提取

1.3.1.1 超聲波輔助提取

依照超聲波輔助提取黃酮的方法[12-13]，設計藜麥黃酮提取的工藝流程：稱取0.5 g 干燥粉末→超聲波輔助乙醇提取→離心分離→過濾→濃縮→定容棕色容量瓶→避光保存備用。

1.3.1.2 熱回流提取

依照熱回流提取黃酮的方法[10-11]，設計藜麥黃酮提取的工藝流程：稱取0.5 g 干燥粉末→浸提劑浸泡→熱回流提取→冷卻→過濾→濃縮→定容棕色容量瓶→避光保存備用。

1.3.2 黃酮量的測定

本研究用比色法測定藜麥總黃酮含量[22]。準確稱取蘆丁標準試劑5.000 mg，用60%乙醇完全溶解后定容至50 mL，搖勻的濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標準溶液。分別吸取蘆丁標準溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于6只10 mL 刻度試管中，用60%乙醇補至5.0 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min 后加入0.3 mL10 %硝酸鋁溶液，放置6 min，再加入4.0 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，混勻，再加0.4 mL 60%的乙醇，室溫（20 ℃左右）放置 15 min 后于波長 501 nm 處測定其吸光度，以60%乙醇溶液為空白對照，建立測定標準曲線和線性回歸方程。蘆丁在0～50 μg/mL 濃度范圍內，以吸光值（y）為縱坐標，蘆丁標準品質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=13.771x-0.013 6（R2=0.998 0）。該結果表明蘆丁在該濃度范圍內吸光值與濃度之間存在良好的線性關系。測定總黃酮含量時，以不同的樣品液代替蘆丁標準溶液，其他步驟與制作蘆丁標準方程相同。計算公式如下：

式中：C 為測定樣液的濃度，mg/mL；V0為測定吸光度所用樣液的體積，mL；V1為測定時稀釋體積，mL；V2為樣液定容后體積，mL；W 為樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取時間對總黃酮含量提取的影響

在提取溫度為60 ℃，超聲波功率為60 W 條件下，分別提取 25、35、45、55 min，進行總黃酮含量測定，分析提取時間對提取藜麥種子總黃酮含量的影響。

1.3.3.2 超聲波功率對總黃酮含量提取的影響

在提取溫度為60 ℃的條件下，超聲功率分別為30、40、50、60 W 時，提取 35 min，進行總黃酮含量測定，分析超聲功率對提取藜麥種子總黃酮含量的影響。

1.3.3.3 提取溫度對總黃酮含量提取的影響

在超聲波功率為60 W 的條件下，提取溫度分別為 50、60、70、80 ℃時，提取 35 min，進行總黃酮含量測定，提取溫度對提取藜麥種子總黃酮含量的影響。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以提取時間（X1）、超聲波功率（X2）、提取溫度（X3）3 個因素為自變量，將各自最優條件的范圍編碼為-1、0、1，并以總黃酮含量為指標設計出17 組響應面試驗。通過Design Expert8.0 軟件對試驗數據進行回歸分析，得到藜麥種子總黃酮提取的最優工藝參數。中心組合試驗的因子及編碼值見表1。

表1 中心組合試驗的因子及編碼值Table 1 Factors and encoding values of central composite test

1.3.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2007 軟件分析整理數據，計算標準誤差并制圖分析；采用Design Expert8.0 軟件設計響應面試驗方案，建立模型并進行多元回歸分析。每個試驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量的單因素試驗

2.1.1 提取時間對總黃酮含量的影響

在溫度為60 ℃，超聲波功率為60 W 的條件下，考察不同提取時間對總黃酮含量的影響，見圖1。

圖1 提取時間對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on total flavonoids content

結果表明，總黃酮含量隨提取時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，提取時間在35 min 時總黃酮含量達到最大值。推測原因在于隨著提取時間的增加，到達35 min 時，藜麥種子內的黃酮已被全部提取出，但隨著提取時間的繼續延長，黃酮類物質可能發生降解[23]，反而導致總黃酮含量下降。故確定提取時間最佳為35 min。

2.1.2 超聲波功率對總黃酮含量的影響

在溫度為60 ℃，提取時間為35 min 的條件下，考察不同超聲波功率對總黃酮含量的影響，見圖2。

圖2 超聲波功率對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on total flavonoids content

結果表明，總黃酮含量隨著功率的提高而逐漸增大，在超聲波功率為40 W 時總黃酮含量達到最高值。而隨著超聲波功率進一步增加，總黃酮含量呈現下降趨勢。超聲波輔助乙醇提取的方法依賴于液體的空化作用，超聲波功率的增加可導致其空化效應的增強[24]，加速溶劑進入藜麥種子粉末的內部，促進黃酮物質的浸出。但當超聲波功率過大時，超聲瞬時熱效應明顯，過高的溫度可能導致黃酮類物質分解或者被氧化，總黃酮含量降低。故確定超聲波功率最佳為40 W。

2.1.3 溫度對總黃酮含量的影響

在提取時間為35 min，超聲波功率為60 W 的條件下，考察不同溫度對總黃酮含量的影響，見圖3。

圖3 溫度對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on the content of total flavonoids

結果表明，總黃酮含量隨溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，溫度在60 ℃時總黃酮含量達到最大值。是因為一定程度的溫度增加，可以使物質的溶解度增大，增加黃酮類物質分子和溶劑分子的碰撞機會，提高其溶出率。但是溫度過高會導致溶劑汽化，破壞黃酮類物質的結構，反而降低總黃酮含量。故確定最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應面分析法優化提取條件結果分析

2.2.1 工藝參數優化

采用Box-Benhnken 中心組合試驗設計，根據單因素結果，以提取時間35 min（X1）、超聲波功率40 W（X2）和提取溫度 60 ℃（X3）為中心點，用響應面分析方法進行三因素三水平優化試驗，中心試驗設計及試驗結果見表2。

表2 中心試驗設計及試驗結果Table 2 Center test design and test results

以總黃酮含量Y 為響應值，利用Design Expert 8.0軟件進行回歸擬合，得到總黃酮含量預測值對編碼自變量的回歸方程：

總黃酮含量 Y=0.31-3.750×10-3X1+1.125×10-2X2-7.5×10-3X3-2.5×10-2X1X2+7.5×10-3X2X3+2.5×10-3X1X3-7×10-2X12-2×10-2X22-4.25×10-2X32

對該模型進行顯著性方差分析，分析結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance Analysis of regression model

從表3 可以看出，該模型決定系數為R2=99.39%，調整后系數R2Adj=98.61%，說明模型能解釋98.61%響應值的變化[25]，模型的P 值為＜0.000 1，說明模型的回歸極顯著；失擬項的P 值為0.913 6，不顯著，說明該模型與實際情況擬合極好，試驗誤差小。因素一次項X2、X3，交互項 X1X2和二次項 X12、X22、X32對總黃酮含量的影響是極顯著（P＜0.01）的，交互項X2X3對總黃酮含量有顯著影響（0.01＜P＜0.05），因素一次項X1和交互項X1X3對結果影響不顯著（P＞0.05）?？梢杂?F 值推測得出各因素的主效關系：超聲波功率（X2）＞提取溫度（X3）＞提取時間（X1）。

2.2.2 響應曲面試驗結果分析

為了更直觀地表現兩因素間的交互作用對總黃酮含量提取的影響，根據提取時間、超聲波功率和提取溫度影響的藜麥種子總黃酮含量，控制某一因素不變，改變另外兩個因素，繪制響應面圖和等高線圖，見圖4～圖 6。

圖4 超聲波功率、提取時間對總黃酮含量的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of total flavonoids content by ultrasonic power and extraction time

圖5 溫度、超聲波功率對總黃酮含量的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of total flavonoids content of temperature and ultrasonic power

圖6 溫度、提取時間對總黃酮含量的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of total flavonoids content in temperature and extraction time

兩兩因素間的交互作用對響應值影響水平可由等高線的形狀來確定，橢圓形表明兩因素交互作用顯著，圓形則為交互作用不顯著[26]。由圖4 和圖5 可知，提取時間和超聲波功率兩因素之間，提取溫度和超聲波功率之間交互作用顯著；由圖6 可知，提取溫度和提取時間之間交互作用不明顯。由圖4～圖6 可知，響應面開口向下。隨著每個因素的增大，響應值增大，當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小。該模型有穩定點，且穩定點是最大值。等高線圖中的曲線都是隨著響應面的增加而形成一個頂點，也就是最佳提取量。

為確定最佳提取量，將回歸方程求偏導，取值為零，得到如下三元一次方程組：

求解得 X1=-0.086；X2=0.323；X3=-0.062，分析該模型得到總黃酮含量最佳條件為提取時間34.57 min，超聲波功率41.62 W 和提取溫度59.37 ℃，在此條件下藜麥種子總黃酮含量的理論值可達0.3122%。由于實際操作的局限性，修正理論值為提取時間35 min，超聲波功率42 W，提取溫度59 ℃。在修正后的條件下進行3次重復的驗證試驗，結果總黃酮含量為0.31 %，與理論值相近，證明該模型能準確預測藜麥種子總黃酮含量。

2.3 超聲波輔助提取黃酮與熱回流提取黃酮方法效率比較結果

超聲波輔助提取黃酮與熱回流提取黃酮方法效率比較結果，見表4。

表4 黃酮總量超聲波輔助提取與熱回流提取比較Table 4 Ultrasonic assist extraction of total flavonoids and comparison of hot reflux extraction

超聲波輔助提取總體水平比熱回流法提取效率高。超聲波輔助提取法提取最適條件為提聲波功率為42 W，提取溫度59 ℃，提取時間35 min，此條件下平均提取含量為0.31%；熱回流法提取最適條件為提取溫度59 ℃，超聲波功率0 W，提取時間35 min，此條件下平均提取含量為0.26%。相比較而言，超聲波輔助提取法的平均提取量為熱回流法的1.19 倍。

用超聲波輔助提取法種子中的黃酮類化合物優于用熱回流提取法提取黃酮類化合物，分析原因可能是超聲波輔助提取法比熱回流法更能快速促進藜麥種子細胞中黃酮類成分的溶出。

3 結論

本試驗采用響應面分析法優化藜麥種子總黃酮含量的最佳提取工藝，由方差分析得出超聲波功率對藜麥種子提取的總黃酮含量的影響最大，提取溫度次之，提取時間最小。得出其最佳工藝條件為：提取時間35 min、超聲波功率42 W 和提取溫度為59 ℃，在此條件下，總黃酮含量可達0.31%。與熱回流提取黃酮方法相比較，同等提取溫度和提取時間的情況下，超聲波提取黃酮法有明顯優勢，平均提取含量可達熱回流法的1.19 倍。表明超聲波可以增加溶劑分子與物質分子的接觸，促進提取物黃酮的溶出，增加提取藜麥種子的總黃酮含量，提高提取效率。

本試驗可以在一定程度上提高藜麥黃酮的提取率，增加其產量，以促進藜麥黃酮類物質的開發利用，為多種黃酮類藥物和保健品的生產提供一定的物質保障。