劉元林，龍鳴，田曉靜，，*，張福梅，陳士恩，馬忠仁，，諾茹·伊扎·諾丁

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730124：2.西北民族大學生物醫學研究中心中國-馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅蘭州730030；3.馬來西亞標準與工業研究所工業生物技術研究中心，雪蘭莪州莎阿南新區40700）

我國枸杞資源豐富，共有7 個品種和3 個變種，主要分布在西北地區[1]。枸杞具有滋補作用，可入藥，現代醫學表明：枸杞具有降血糖、抗腫瘤、免疫調節、補腎、抗氧化、抗輻射、降血壓、抗衰老、抗疲勞、保肝、明目等功效[2]。枸杞黃酮具有多種保健作用[3-6]，如何從植物中提取純度高、活性高的黃酮類物質，將黃酮進一步加工成具有抗癌、抗衰老、調節內分泌等功能的保健食品成為熱點。目前黃酮提取方法主要為有機溶劑提取法[7]、超聲波法[8-9]、微波輔助酶法[10]、酶解法等[11]；黃酮含量檢測方法有分光光度法[12]、色譜法[13]、薄層色譜法等[14-15]。目前對枸杞黃酮研究主要在提取工藝的比較與優化方面，通過分析枸杞黃酮含量判定枸杞品質的研究較少。

本文通過對比分析超聲波提取法、乙醇浸提法以及酶提法提取枸杞黃酮的效果，得出較佳提取方法，在此基礎上，采用單因素試驗研究超聲波功率、超聲時間以及乙醇濃度3 個因素對黃酮提取的影響規律，再采用三因素三水平正交試驗優化超聲波提取工藝。在優化提取條件下，結合顯著性分析和主成分分析研究不同產地、品種枸杞黃酮提取率的差異，為監督市場枸杞的品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同產地、品種枸杞樣品購于寧夏中寧市場信息見表1 與表2，15 種市售枸杞樣品信息見表3，樣品購回后置于-4 ℃冷藏待用。

722E 型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；KQ2200DE 數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SXT-06 索式提取器：上海洪紀儀器設備有限公司；H2050R 臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機器有限公司；DG120 型中藥材粉碎機：浙江省瑞安壽海藥材器械廠；CR-10 便攜式積分球分光光度儀（色差計）：日本Konica Minolta 公司。

表1 不同地區枸杞樣品信息表Table 1 Sample information of Lycium barbarum L.from different regions

表2 不同品種枸杞樣品信息表Table 2 Sample information of Lycium barbarum L.of different varieties

表3 15 種市售枸杞樣品基本信息表Table 3 Sample information of 15 comercially avaiable Lycium barbarum L.

蘆丁：合肥博美生物科技有限責任公司；石油醚、無水乙醚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：天津市百世化工有限公司；果膠酶（10 000 U/g）：東莞市瓦里西化工有限公司；藥品均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

將枸杞洗干凈，置于55 ℃烘箱干燥至恒重后粉碎，以密封袋密封，置于-4 ℃冷藏待用。

1.2.2 黃酮提取率測定

參照劉景煜等[16]所用方法，采用分光光度計法測定枸杞黃酮含量。以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制出標準曲線。用最小二乘法作線性回歸，可以得出蘆丁濃度C（μg/mL）與吸光度A 的關系曲線，回歸方程式：A=0.003 9C+0.005 8，R2=0.993 1，在 0～110 μg/mL區間有較好的線性相關性。

式中：A 為由標準曲線算得被測液中黃酮含量，μg；M 為試樣質量，g；V1為測定用試樣體積，mL；V2為試樣定容體積，mL。

1.2.3 單因素試驗

參照枸杞黃酮提取[17-19]文獻，采用乙醇浸提法、超聲波提取法、酶提取法提取枸杞黃酮，對比分析獲得較佳的提取方法。在此基礎上，以枸杞黃酮提取率為指標，通過單因素試驗研究超聲功率（60、70、80、90、100 W）；提取時間（10、15、20、25、30 min）；乙醇濃度（55%、65%、75%、85%、95%）對枸杞黃酮提取率的影響規律。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平正交試驗優化提取工藝，進行L9（34）正交試驗，其因素水平設計表見表4。

表4 正交試驗因素水平表Table 4 Orthogonal test factors and levels

1.2.5 基本物理參數測定

參照 GB/T18672-2014《枸杞》[20]和 SN/T0878-2000《進出口枸杞檢驗規程》[21]，采用稱量方法測定百粒重；結合稱量與計數測量粒度；使用游標卡尺測量枸杞長軸長和短軸長；采用色差計測量a*、b*、L*。每個參數重復檢測3 次，以其平均值進行后續分析。

1.2.6 粗脂肪含量的測定

參照衛斌頡[22]的方法測定枸杞脂肪。

1.3 數據處理

采用顯著性分析（significance test）與主成分分析（principle component analysis，PCA）對不同產地、品種和市售枸杞進行定性判別；試驗數據采用SAS 8.0 軟件（美國SAS 軟件公司）進行數據分析，試驗結果圖由Origin 8.0 軟件（美國 OriginLab 公司）繪制。

2 結果與分析

2.1 3種提取方法比較

3 種提取方法結果見圖1。

圖1 3 種提取方法結果比較Fig.1 The results of three extraction methods are compared

由圖1 可知，超聲波提取法黃酮提取率顯著高于其他兩種方法，乙醇浸提法與酶提取法黃酮提取率差異不顯著，與韓秋菊等[17]結果一致，故超聲波提取法提取效果更佳。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲功率與黃酮提取率的關系

超聲功率對枸杞黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對枸杞黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of Ultrasonic power on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由圖2 可知，在料液比為 1 ∶30（g/mL）、乙醇濃度為85 %、提取溫度為80 ℃、提取時間為15 min、提取2 次的條件下，發現枸杞黃酮提取率隨著超聲功率升高而上升，當超聲功率到達80 W 時，提取率隨超聲功率升高而降低，可能是功率過大造成溫度上升，在一定程度上破壞黃酮提取物或使乙醇揮發，故提取枸杞黃酮較佳超聲功率為80 W。

2.2.2 乙醇濃度與黃酮提取率的關系

乙醇濃度對枸杞黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對枸杞黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of Ethanol concentration on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由圖3 可知，在料液比為 1 ∶30（g/mL）、超聲功率為80 W、提取溫度為80 ℃、提取時間為15 min、提取2 次的條件下，枸杞黃酮提取率隨乙醇濃度升高而上升，乙醇濃度為85%時枸杞黃酮提取率最大，超過85%時枸杞黃酮提取率反而變小，故較佳乙醇濃度為85%。

2.2.3 超聲時間與黃酮提取率的關系

超聲時間對枸杞黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對枸杞黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of Ultrasonic time on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由圖4 可知，在料液比為 1 ∶30（g/mL）、超聲功率為80 W、提取溫度為80 ℃、乙醇濃度為85 %、提取2次的條件下，隨超聲時間延長枸杞黃酮提取率先上升后下降，在提取時間為25 min 時最大，30 min 時提取率下降，可能是時間過長黃酮提取物發生一定程度水解，故提取枸杞黃酮較佳超聲時間為25 min。

2.3 正交試驗結果

以超聲功率、乙醇濃度、超聲時間為因素，以黃酮提取率為指標，采用三因素三水平正交試驗優化，其設計表和結果見表5。

表5 正交試驗結果表Table 5 Orthogonal test results table

由表5 可知，根據極差分析影響順序為B＞A＞C，即乙醇濃度對枸杞黃酮的提取效果影響最為顯著，其次為超聲功率，最后為超聲時間。較佳提取條件為A3B2C2，即超聲功率90 W、乙醇濃度85 %、超聲時間25 min，提取2 次，此時枸杞黃酮提取率為2.267%。該結果與韓秋菊等[17]結果接近，但本研究各參數均略高于文獻報道，同時黃酮提取率也略高。

2.4 不同產地枸杞品質差異分析

不同產地枸杞主成分分析結果見圖5。

圖5 不同產地枸杞主成分分析結果Fig.5 Results of principal component analysis of Lycium barbarum L.in different habitats

由圖5 可知，以不同產地枸杞物理參數和黃酮提取率進行主成分分析時，第1 主成分為45.54%，第2主成分為21.60%，累積貢獻率為67.14%，基本可以代表枸杞的原始信息。不同產地枸杞物理指標存在一定的差異性，寧夏產的枸杞粒度較大，粒子小且輕，a*、b*與其他地區差異顯著、寧夏枸杞位于最右方；甘肅瓜州枸杞百粒重與粒度在青海與寧夏中寧枸杞樣品之間、甘肅瓜州與青海產的枸杞a*、b*差異不顯著，甘肅瓜州枸杞位于中間；青海產枸杞粒子大且重，青海枸杞位于左方。寧夏中寧、甘肅瓜州、青海產的枸杞中的黃酮提取率、百粒重、粒度差異顯著，3 種產地分離效果較好，這與劉曉慧等[23]、張波等[24]結果一致，以基本物理指標與黃酮提取率為輸入，采用主成分分析實現了不同產地有效的區分。

2.5 不同品種枸杞品質差異分析

不同品種枸杞主成分分析結果見圖6。

圖6 不同品種枸杞主成分分析結果Fig.6 Results of principal component analysis of different varieties of Lycium barbarum L.

由圖6 可知，以不同品種枸杞物理參數和黃酮提取率進行主成分分析時，第1 主成分為72.89%，第2主成分為20.65%，總貢獻率達93.54%，代表了原始數據的很大部分信息。中寧枸杞、新品種5 號與小顆粒3 個品種百粒重、粒度、橫縱軸、色差、黃酮提取率都存在顯著差異，粒度與黃酮提取率小顆粒顯著高于其他兩個品種，百粒度、橫縱軸小顆粒顯著低于其他兩個品種，就色差而言小顆粒b*最大，故小顆粒品種分布在右側，其他樣品分布在左側，不同樣品彼此分離，且不同產地枸杞組間彼此區分，能實現3 個不同品種枸杞的區分。這與述小英等[25]以主成分和聚類分析對不同品種枸杞果實功能營養成分的區分結果一致。

2.6 市售枸杞品質差異

對15 種市售枸杞的百粒重、粒度、長短軸、脂肪含量、黃酮提取率進行檢測，結果見表6。

從表6 中可知，15 種枸杞的黃酮提取率差異顯著，但寧夏中衛的NA 與QY 黃酮提取率差異不顯著；寧夏銀川的HM 與QL 黃酮提取率差異不顯著；新疆的HL 與寧夏中衛的TZ 與YC 黃酮提取率差異不顯著；長短軸部分市售枸杞差異不顯著；百粒重、粒度、脂肪含量15 種市售枸杞差異性顯著。

15 種市售枸杞主成分分析結果見圖7。

由圖7 可知，以15 種市售枸杞物理參數和黃酮提取率為參數進行主成分分析時，第1 主成分為66.24%。第2 主成分為21.00%，總貢獻率達87.24%，代表了原始數據大部分信息。青海產枸杞（YCT、QH）與新疆產枸杞HL 跟其他產地枸杞分離；寧夏地區中衛、中寧與銀川產的枸杞不易區分開；陜西咸陽產的XY 與寧夏產枸杞不易區分開，原因可能為兩產地距離相對其他地區近，由此能實現市售枸杞的區分，這與2.4 中不同產地主成分分析結果一致。

表6 市售枸杞的基本參數Table 6 The basic parameters of Lycium barbarum L.

圖7 市售枸杞主成分分析結果Fig.7 The analysis results of the main components of Lycium barbarum L.

3 結論

研究發現，對枸杞黃酮提取而言，超聲波提取法優于乙醇浸提法和酶提取法。采用三因素三水平正交試驗優化超聲波提取法工藝條件，獲得較佳的提取條件為A3B2C2，即濃度為85%乙醇，超聲波功率為90 W，提取時間為每次25 min，提取次數2 次時，此時枸杞黃酮提取率為2.267%。在優化的條件下，研究不同產地、品種枸杞樣品及15 種市售枸杞黃酮含量差異，發現不同產地、品種枸杞黃酮含量存在顯著性差異，甘肅產枸杞黃酮含量顯著高于寧夏與青海產枸杞；寧夏小顆粒枸杞黃酮含量高于新品種5 號與中寧枸杞；對市售枸杞，黃酮提取率差異性顯著，但部分品牌枸杞間黃酮提取率差異性不顯著；主成分分析結果表明枸杞物理參數和黃酮提取率可實現對不同產地、品種和市售枸杞樣品的區分。