女貞子提取物中齊墩果酸含量及抗腫瘤活性研究

王沛君，王森業，徐瑞芳，馮瑞，張磊，李曉楠，孫顏杰，2，*

（1.新鄉醫學院三全學院，河南新鄉453000；2.新鄉醫學院，河南新鄉453000）

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果實，在浙江、江蘇、河南等均有產，味甘、苦，性涼，歸肝、腎經，常用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發早白，目暗不明，內熱消渴，骨蒸潮熱等[1]。有研究表明，齊墩果酸是女貞子中的重要活性成分之一，具有護肝腎[2]、抗病毒[3]、調血脂[4]、抗菌[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]等多種藥理作用。近年來對女貞子中齊墩果酸的提取工藝甚多，常見的有回流提取法、超聲波輔助提取法、冷浸法等。如蔣珍菊[8]、莫穎華[9]、郗艷麗[10]對女貞子中齊墩果酸的提取進行了一定的探索和優化，但是較少文獻比較不同提取方法提取的效果。因此本試驗采用乙醇回流法、超聲輔助提取法、索氏提取法、冷浸法4 種方法對女貞子中的齊墩果酸進行提取，確定最佳工藝；文獻報道女貞子主要成分齊墩果酸具有抑制人乳腺癌、肺癌細胞（MCF27）增殖和誘導凋亡的作用[11]，董靜[12]報道齊墩果酸對S180 荷瘤小鼠腫瘤細胞的凋亡有明顯的影響，細胞凋亡發生率明顯增加，也指出女貞子中天然有效成分齊墩果酸可下調腫瘤細胞中的B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）蛋白的表達，使腫瘤細胞中細胞色素C 與Caspase-3 的表達水平增高，從而達到抑制荷瘤小鼠腫瘤的增長的作用。本試驗在已有研究的基礎上以人結腸癌細胞和肝癌細胞為研究對象，對女貞子提取物體外抗腫瘤活性做進一步研究，觀察細胞的形態變化，探討誘導細胞凋亡的影響，推動提取物的臨床應用，為開發女貞子提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

女貞子于2017年11月采自河南省新鄉市新鄉醫學院三全學院，將材料于50 ℃烘箱中干燥，保存于新鄉醫學院三全學院藥學院，備用。

1.1.2 儀器

N4 紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司制造；BT125D 電子分析天平：賽多利斯科學儀器北京有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：金壇市華峰儀器有限公司制造；101 型電熱鼓風干燥箱：上海科恒實業發展有限公司；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；SENCO 旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司；SHB-3 循環多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；CX22 倒置顯微鏡：奧林巴斯公司；CO2培養箱：英國Biotech 公司；ELISA 分光光度計：上海光譜儀器有限公司；KQ-500E 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 試劑

齊墩果酸標準品（C1723001）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司、噻唑藍（MTT）：Sigma 試劑公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、95%乙醇、無水甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸、香草醛、高氯酸：天津市德恩化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備

1.2.1.1 超聲輔助提取法

稱定女貞子5.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入10 倍量的95%乙醇，超聲輔助提取30 min，過濾，重復3 次，合并3 次濾液，減壓濃縮干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.2 索氏提取法

稱定女貞子5.0 g，置于索氏提取器中，加入10 倍量的95%乙醇，在85 ℃下回流3 次，每次2 h，合并3次濾液，減壓濃縮干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.3 回流提取法

稱取女貞子5.0 g，置于250 mL 圓底燒瓶中加10倍量的95%乙醇回流提取，每次2 h，重復3 次，合并3 次濾液，減壓濃縮干燥得女貞子提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.4 冷浸法

稱定女貞子5.0 g，參考秦晶晶等[13]文獻制備，減壓濃縮干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.2 齊墩果酸標準曲線的繪制

參照李西騰等[14]文獻，精密稱取齊墩果酸標準品5.0 mg，加甲醇定容于50 mL 容量瓶中，搖勻即得濃度為0.10 mg/mL 的對照品溶液。精密吸取齊墩果酸標準品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于試管中，80 ℃水浴蒸干甲醇，加0.2 mL 香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，在60 ℃水浴加熱15 min 后，移入冰水浴中，再加入4.0 mL 的乙酸乙酯，搖勻，在560 nm 處測定吸光度值。以齊墩果酸濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程，計算R2。

1.2.3 精密度試驗

分別精密吸取6 份對照品溶液0.3 mL，按1.2.2 項下方法測定吸光度值，計算平均值及RSD（%）值。

1.2.4 穩定性試驗

精密吸取1.2.1.3 項下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液。分別精密吸取 6 份上述稀釋液 0.5 mL，于 0、2、4、6、8、10 h 按 1.2.2方法測定吸光度值，計算平均值及RSD（%）值。

1.2.5 重復性試驗

精密吸取1.2.1.3 項下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液，分別精密吸取6 份上述稀釋液0.5 mL，按1.2.2 方法測定吸光度值，計算平均值及RSD（%）值。

1.2.6 加樣回收率試驗

精密吸取1.2.1.3 項下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液，分別精密吸取6 份上述稀釋液0.2 mL，再加入對照品溶液0.2 mL，按1.2.2 項下方法操作，測定吸光度值，計算平均值及RSD（%）值。

1.2.7 樣品的含量測定

分別精密吸取1.2.1 項下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液，分別精密吸取3 份上述稀釋液0.5 mL，按1.2.2 項下方法測定吸光度值，運用回歸方程計算樣品含量。

1.3 女貞子提取物對腫瘤細胞增殖影響

1.3.1 MTT 的配制

MTT 在無菌條件下，用高壓過的磷酸緩沖鹽溶液（phosphste buffer saline，PBS）配成 2 mg/mL，0.22 μm 無機濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 藥物稀釋

稱取藥物，使用90 % DMSO 作為溶劑，配成14.000 mg/mL，并用 0.22 μm 有機濾膜過濾除菌，4 ℃保存。使用時按等比例稀釋依次用90%DMSO 配成相應的濃度，使用后，藥物保存于4 ℃。

1.3.3 細胞處理

將細胞培養在含10%新鮮滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，于恒溫培養箱（37 ℃，5%CO2）。結合李康等[15]文獻，待HCT116 與HepG2 細胞生長良好并處于對數生長期時用0.25%的胰酶消化，收集并計數，均勻的鋪到 96 孔板中（約 7×103個/孔），在二氧化碳恒溫培養箱中培養24 h，當細胞完全貼壁并且呈對數生長期時，加入各濃度梯度的藥物，同時設置陽性對照組（90%DMSO），每個藥物濃度設置3 個復孔。在相同條件的培養箱中繼續培養24 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。在二氧化碳恒溫培養箱中孵育48 h 后，每孔加入 10 μLMTT（2 mg/mL），在二氧化碳恒溫培養箱中繼續孵育4 h 后，終止培養，吸去培養孔中的液體。每孔加入100 μL DMSO 溶液，并設置空白對照組。置于低速搖床上振蕩10 min，以溶解殘留的MTT-甲臜結晶，于多功能酶標儀上495 nm 處測定各孔的吸光度。以吸收抑制百分比為生長抑制率，試驗重復3 次，按照公式：生長抑制率/%=1-[（試驗組OD值-空白孔OD 值）/（陽性對照組OD 值-空白對照組OD 值）]×100，計算女貞子提取物對兩種癌細胞增殖的抑制效果，齊墩果酸標準品步驟同上，并計算半數抑制濃度。

1.3.4 數據統計分析

試驗數據繪圖采用Microsoft Excel 2010 進行，數值表示為平均值D，半數抑制濃度采用SPSS.22 進行計算。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制備

以齊墩果酸濃度x（μg/mL）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，通過線性擬合得回歸方程為y=0.008 8x-0.065 5，相關系數R2=0.999 5 大于0.99，標準曲線見圖1。表明齊墩果酸濃度在 20 μg/mL～120 μg/mL 范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

圖1 齊墩果酸的標準曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 精密度試驗結果

精密度試驗結果見表1。

由表1 可知，測得6 份齊墩果酸標準品溶液的平均吸光度值為0.171，相對標準偏差值（relative standeard deviation，RSD）為0.52%，表明本試驗的精密度良好。

表1 精密度試驗結果（n=6）Table 1 The results of precision experiment（n=6）

2.3 穩定性試驗結果

穩定性試驗結果見表2。

表2 穩定性試驗結果（n=6）Table 2 The result of stability experiment（n=6）

由表2 可知，測得 0、2、4、6、8、10 h 供試品溶液的平均吸光度值為0.512，相對標準偏差值RSD 為0.17%，表明本試驗的穩定性良好。

2.4 重復性試驗結果

重復性試驗結果見表3。

由表3 可知，測得6 份供試品溶液的平均吸光度值為0.171，相對標準偏差值RSD 為0.52%，表明本試驗的重復性良好。

表3 重復性試驗結果（n=6）Table 3 The results of repeatability experiment（n=6）

2.5 加樣回收試驗結果

加樣回收試驗結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n=6）Table 4 The results of sample addition experiment（n=6）

由表4 可知，測得6 份供試品溶液的平均加樣回收率為100.2%，相對標準偏差RSD 為0.76%，表明本試驗的加樣回收率良好。

2.6 不同提取方法中的齊墩果酸含量的結果

按照“1.2.2”項下方法對“1.2.1”項下供試品溶液進行齊墩果酸含量測定，結果見表5。

表5 不同提取方法中的齊墩果酸含量Table 5 Contents of oleanolic acid in different extraction methods

由表5 可知，4 種不同提取方法中的齊墩果酸含量由高到低依次為回流提取法（13.13±0.03）mg/g、索式提取法（12.19±0.03）mg/g、超聲輔助提取法（11.56±0.02）mg/g、冷浸法（11.16±0.02）mg/g。

2.7 女貞子提取物對人結腸癌、人肝癌細胞增殖的影響

2.7.1 女貞子提取物及齊墩果酸標準品干預HCT116細胞48 h 后的細胞形態

女貞子提取物及齊墩果酸標準品干預HCT116 細胞48 h 后的細胞形態見圖2。

圖2 各組干預HCT116 細胞48 h 后的細胞形態（×200）Fig.2 Cell morphology of HCT116 cells after 48 h intervention in each group（×200）

如圖2 所示，女貞子提取物與齊墩果酸標準品作用于HCT116 細胞48 h 后，細胞形態皺縮，有變圓趨勢，且部分細胞有漂浮現象。隨著其濃度的增大，細胞形態受損程度也逐漸增強。由F 與J 兩個圖片對比可知，同濃度下的女貞子提取物與齊墩果酸標準品作用于HCT116 細胞，女貞子提取物使細胞皺縮與受損的程度強于齊墩果酸標準品。

2.7.2 女貞子提取物及齊墩果酸標準品干預HEPG2細胞48 h 后的細胞形態

女貞子提取物及齊墩果酸標準品干預HEPG2 細胞48 h 后的細胞形態見圖3。

圖3 各組干預HEPG2 細胞48 h 后的細胞形態（×200）Fig.3 Cell morphology of HEPG2 cells after 48 h intervention in each group（×200）

如圖3 所示，女貞子提取物與齊墩果酸標準品作用于HEPG2 細胞48 h 后，細胞形態皺縮，有變圓趨勢，且部分細胞有漂浮現象。隨著其濃度的增大，細胞形態受損程度也逐漸增強。由P 與R 兩個圖片對比可知，同濃度下的女貞子提取物與齊墩果酸標準品作用于HEPG2 細胞，女貞子提取物使細胞皺縮與受損的程度強于齊墩果酸標準品。

2.7.3 女貞子提取物及其齊墩果酸標準品對人結腸癌細胞增值的影響

女貞子提取物及其齊墩果酸標準品對人結腸癌細胞增值的影響見圖4。

如圖4 所示，不同濃度的女貞子提取物與齊墩果酸標準品作用于人結腸癌細胞48 h 后，經過MTT 法檢測發現，當女貞子提取物濃度為0.05 μg/mL 時對人結腸癌細胞的抑制率為0.57%，齊墩果酸標準品濃度為0.05 μg/mL 時對人結腸癌細胞的抑制率為0.10%，當兩者的濃度增加到35.00 μg/mL 時，對人結腸癌細胞的抑制率分別為88.58%、86.93%，由此可見女貞子提取物與齊墩果酸標準品對人結腸癌細胞的抑制作用呈現出一定的濃度相關性，且女貞子提取物對人結腸癌細胞的抑制作用強于齊墩果酸標準品。

圖4 女貞子提取物及其齊墩果酸標準品對人結腸癌細胞增值的影響Fig.4 Effect of Fructus Ligustri Lucidi and the standard oleanolic acid on the proliferation of human colon cancer cells

2.7.4 女貞子提取物及其齊墩果酸標準品對人肝癌細胞增值的影響

女貞子提取物及其齊墩果酸標準品對人肝癌細胞增值的影響見圖5。

圖5 女貞子提取物及齊墩果酸標準品對人肝癌細胞增值的影響Fig.5 Extract of Fructus Ligustri Lucidi and the standard oleanolic acid on the proliferation of liver cancer cells

如圖5 所示，不同濃度的女貞子提取物與齊墩果酸標準品作用于人肝癌細胞48 h 后，經過MTT 法檢測發現，當女貞子提取物濃度為0.05 μg/mL 時對人肝癌細胞的抑制率為7.31%，齊墩果酸標準品濃度為0.05 μg/mL 時對人結腸癌細胞的抑制率為4.96%，當兩者的濃度增加到35.00 μg/mL 時，對人肝癌細胞的抑制率分別為84.47%、78.00%，由此可見女貞子提取物與齊墩果酸標準品對人肝癌細胞的抑制作用也呈現出一定的濃度相關性，且女貞子提取物對人肝癌細胞的抑制作用強于齊墩果酸標準品。

由以上數據計算得女貞子提取物對人結腸癌細胞和人肝癌細胞 48 h 后的 IC50值分別為 22.08、13.47 μg/mL，齊墩果酸標準品對人結腸癌細胞和人肝癌細胞 48 h 后的 IC50值分別為 41.45、45.90 μg/mL。

3 結論

通過試驗比較得出齊墩果酸的含量由高到低依次為回流提取法、索氏提取法、超聲輔助提取法、冷浸法，與秦晶晶等[16]結果一致。超聲輔助提取法，耗時短，易控制反應條件，但提取含量較低；冷浸法，操作簡單，但耗時長，耗材大，提取含量最低；索氏提取法僅次于乙醇回流，但由于裝置的特點，盛裝藥材有限，因此不作為首選工藝；乙醇回流法，操作簡單，提取效率最高，因此首選乙醇回流提取法。

近年來，中藥及其提取物在抗腫瘤的治療研究中發揮著越來越重要的作用[17]，如高飛等[18]發現竹葉提取物具有潛在的抗腫瘤和神經保護的雙重功效，譚輝等[19]發現紫山藥花青素有一定的抗腫瘤效應。因此，改進和完善女貞子有效活性成分的提取工藝，深入研究其抗腫瘤成分及作用機制，對天然藥物在抗腫瘤領域的應用有積極意義。

在體外抗腫瘤實驗中，通過比較女貞子提取物和齊墩果酸標準品對兩種癌細胞的IC50值，發現女貞子提取物對人結腸癌細胞的IC50值（22.08 μg/mL）小于齊墩果酸標準品對其的 IC50值（41.45 μg/mL），對人肝癌細胞的IC50值（13.47 μg/mL）小于齊墩果酸標準品對其的 IC50值（45.90 μg/mL），表明女貞子提取物對兩種癌細胞的增殖均有顯著的抑制作用，同時可以得出該提取物對人肝癌細胞的選擇性優于結腸癌細胞，該差異考慮可能是關系到該提取物對兩種腫瘤細胞的抑制機理不同，為以后抗腫瘤機制分析提供參考。這也是首次發現女貞子提取物對人結腸癌細胞HCT116有抑制作用，為充分開發利用女貞子提供了科學的參考依據。