類過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

陳錳 上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203

類過敏反應(yīng)已嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量，其癥狀與Ⅰ型過敏反應(yīng)極為相似，涉及多器官系統(tǒng)，類過敏反應(yīng)的發(fā)生率遠(yuǎn)高于過敏反應(yīng)，二者經(jīng)常被混淆，但有著本質(zhì)區(qū)別，類過敏反應(yīng)通常在首次接觸致敏原即發(fā)生，是無需IgE介導(dǎo)的非抗原抗體反應(yīng)。類過敏反應(yīng)發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前國內(nèi)外對此尚不完全清楚，相關(guān)研究推測類過敏反應(yīng)主要通過直接刺激MC途徑和激活補(bǔ)體系統(tǒng)途徑而引發(fā)。截至今日，國內(nèi)外均未建立統(tǒng)一的檢測模型用于類過敏反應(yīng)的臨床前評價(jià)，也沒有相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)原則發(fā)表【1】。因此，本文對類過敏反應(yīng)相關(guān)體內(nèi)外模型及實(shí)驗(yàn)方法研究進(jìn)行綜述，旨在為類過敏反應(yīng)的檢測建立統(tǒng)一的臨床前評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供指導(dǎo)，盡可能地減少藥物類過敏反應(yīng)的發(fā)生，保障臨床用藥安全。

1 整體動物實(shí)驗(yàn)研究：

選擇一種合適的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行類過敏反應(yīng)的評價(jià)備受關(guān)注，目前已經(jīng)進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)動物主要有Beagle犬、小型豬、豚鼠、大鼠和小鼠等，恒河猴和食蟹猴報(bào)道較少。不同動物或不同品系動物模型的敏感性及效應(yīng)物質(zhì)評價(jià)指標(biāo)略有不同，下面逐一進(jìn)行贅述。

1.1 Beagle犬模型：

有較多研究報(bào)道Beagle犬在首次靜脈注射致敏物質(zhì)后很快出現(xiàn)與人類相似的類過敏反應(yīng)癥狀，將Beagle犬出現(xiàn)的典型癥狀與其血漿組胺升高率為主要指標(biāo)，IgE為輔助指標(biāo)進(jìn)行類過敏反應(yīng)的評價(jià)。梁愛華等【2】以Beagle犬為受試動物，以含吐溫-80 和不含吐溫-80魚腥草注射液為主要受試藥物給與動物，發(fā)現(xiàn)Beagle犬迅速出現(xiàn)類過敏反應(yīng)，并表現(xiàn)出與臨床高度一致的癥狀特點(diǎn)，建議作為中藥類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)研究的理想動物模型。此外，梁愛華等【3】也進(jìn)一步證實(shí)Beagle犬作為臨床前評價(jià)藥物類過敏反應(yīng)動物模型的可行性。王志國等【4】通過對Beagle犬一次靜脈注射磷酸組胺注射液模擬臨床類過敏反應(yīng)的發(fā)生，作者認(rèn)為Beagle犬可以作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的敏感動物模型。孫偉偉等【5】以Beagle犬為類過敏反應(yīng)的敏感動物模型來評價(jià)多種聚山梨酯80及其配制的魚腥草注射液靜脈注射給藥對Beagle犬的致敏性。該課題組在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)Beagle犬對類過敏實(shí)驗(yàn)很敏感，且得出若控制聚山梨酯80的質(zhì)量及限制其濃度可避免類過敏反應(yīng)的發(fā)生。Qiu等【6】通過向Beagle犬注射吐溫80考察其致敏性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Beagle犬在生理指標(biāo)的變化上與人類極為相似。閆位娟等【7】將臨床過敏性報(bào)道較多的中藥注射劑對Beagle犬、豚鼠及小鼠進(jìn)行類過敏試驗(yàn)，證明了Beagle犬為類過敏反應(yīng)的最佳實(shí)驗(yàn)動物，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

綜上，Beagle犬由于其發(fā)生類過敏反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)與人類極為相似的行為學(xué)癥狀及生理指標(biāo)的改變，敏感性高、重復(fù)性好，其作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)研究的動物模型得到一致認(rèn)可。

1.2 小型豬模型：

小型豬作為動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)報(bào)道不多，有研究表明其對脂質(zhì)體引起的補(bǔ)體激活最為敏感。Dezsi等【8】通過對小型豬及大鼠靜脈注射脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，但小型豬的敏感性明顯大于大鼠。Szebeni等【9】通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微量的脂質(zhì)體即可引發(fā)小型豬的類過敏癥狀，表現(xiàn)為肺動脈高壓、全身低血壓、心輸出量減少和心律失常等 Beagle犬的血流動力學(xué)相關(guān)變化近似于小型豬。

因此，Beagle犬和小型豬相比于大鼠而言更適合用于脂質(zhì)體的類過敏反應(yīng)檢測，但相比之下小型豬更敏感。綜上，小型豬可作為脂質(zhì)體類過敏反應(yīng)檢測的最佳動物模型。

1.3 豚鼠模型：

藥物過敏反應(yīng)中最常用的動物模型即為豚鼠模型。梁愛華等【2】以豚鼠為受試動物，以含0.4%伊文思藍(lán)的去吐溫魚腥草蒸餾液、不同濃度吐溫及含不同濃度吐溫的魚腥草注射液為受試藥物，靜脈注射3.0ml/kg，觀察其30分鐘內(nèi)行為學(xué)變化及耳廓藍(lán)染情況。該研究證實(shí)豚鼠發(fā)生類過敏反應(yīng)的主要特征為耳廓血管通透性增高，且與藥物劑量呈現(xiàn)依賴關(guān)系，但其未表現(xiàn)出臨床出現(xiàn)的典型的類過敏反應(yīng)癥狀。陳素珍等【9】通過對豚鼠及小鼠一次性注射中藥注射劑，觀察到了豚鼠明顯的如豎毛、抓鼻、舔足、搔癢及步態(tài)不穩(wěn)等類過敏樣癥狀，小鼠則未觀察到異常。李春英等【10】通過對豚鼠靜脈一次性注射不同濃度吐溫及含不同濃度吐溫的中藥注射劑，發(fā)現(xiàn)其血管通透性增高，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。閆位娟等【7】對豚鼠一次性均靜脈注射生理鹽水、吐溫80及多種中藥注射劑，給藥劑量為人臨床應(yīng)用劑量的6倍，通過行為學(xué)特征及血漿組胺水平綜合判斷類過敏反應(yīng)。結(jié)果顯示，豚鼠對中藥注射劑的類過敏反應(yīng)不明顯，說明用豚鼠做類過敏試驗(yàn)與人體不完全符合，不夠理想。

綜上，對于豚鼠作為類過敏反應(yīng)評價(jià)的建議各不一致，但基于血管通透性的研究均認(rèn)為其可作為類過敏反應(yīng)研究的動物模型，至于豚鼠能否作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的動物模型有待更多更深入的研究加以驗(yàn)證。

1.4 大鼠模型：

大鼠作為類過敏反應(yīng)的動物模型亦有相關(guān)研究。Dezsi等【8】研究證明大鼠對于脂質(zhì)體的敏感性很小，不建議大鼠作為脂質(zhì)體的類過敏反應(yīng)檢測模型。張立波等【11】以SD大鼠為動物模型，以C48/80為工具藥，對大鼠皮膚類過敏試驗(yàn)的適用性和可靠性進(jìn)行研究。結(jié)果以皮膚藍(lán)斑直徑及藍(lán)斑浸出液OD值為檢測指標(biāo)進(jìn)行判斷，發(fā)現(xiàn)其作為類過敏反應(yīng)監(jiān)測具有敏感性好，結(jié)果可信的特點(diǎn)。因此，SD大鼠可以作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的動物模型。康黎靜等【12】利用前者的大鼠皮膚類過敏試驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法對臨床常用的一些造影劑、化學(xué)合成藥物及中藥注射劑進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)此方法敏感性高，且檢測結(jié)果與給藥劑量具有相關(guān)性，建議此方法可用于藥物類過敏反應(yīng)的臨床前評價(jià)研究。汪懷山等【13】以MABP（平均動脈血壓）為觀測指標(biāo)，觀察大鼠一次性靜脈推注組胺及類過敏陽性物質(zhì)后發(fā)生類過敏反應(yīng)的敏感程度。結(jié)果顯示，大鼠MABP指標(biāo)指示類過敏反應(yīng)的發(fā)生具有很好的敏感性，可以以大鼠MABP為觀察指標(biāo)，將大鼠作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的動物模型。梁愛華等【14】以C48/80為陽性藥對大鼠進(jìn)行皮膚類過敏試驗(yàn)，靜脈注射伊文思藍(lán)，將藍(lán)斑直徑及伊文思藍(lán)滲出量為指標(biāo)來判斷，并用臨床上報(bào)道較多的兩種中藥注射劑進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，此方法驗(yàn)證的結(jié)果與臨床報(bào)道具有一致性，且此方法敏感、可靠，因此，以藍(lán)斑直徑及伊文思藍(lán)滲出量為指標(biāo)的大鼠皮膚類過敏試驗(yàn)方法可用于類過敏反應(yīng)的臨床前評價(jià)。

綜上，大鼠作為類過敏反應(yīng)評價(jià)的動物模型主要是皮膚類過敏試驗(yàn)，通過觀察藍(lán)斑直徑、伊文思藍(lán)滲出量及MABP等指標(biāo)來判斷是否發(fā)生類過敏反應(yīng)，結(jié)果顯示敏感性良好。因此，也可將大鼠皮膚類過敏試驗(yàn)用于類過敏反應(yīng)的臨床前檢測及評價(jià)。

1.5 小鼠模型：

小鼠具有多樣性的分子生物學(xué)和免疫學(xué)特點(diǎn)，經(jīng)常用于過敏及類過敏反應(yīng)的臨床前研究。張宇實(shí)等【15】通過對兩種性別的四種小鼠靜脈注射含有伊文思藍(lán)的中藥注射劑誘發(fā)類過敏反應(yīng)，來考察不同品系及性別的小鼠發(fā)生類過敏反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，ICR小鼠的敏感性優(yōu)于BALB / C、昆明和 C57品系的小鼠，且普遍顯示雄性小鼠的敏感性優(yōu)于雌性，但相關(guān)機(jī)制尚不清楚，建議選用雄性ICR小鼠作為類過敏反應(yīng)的動物模型進(jìn)行類過敏反應(yīng)的臨床前評價(jià)。謝家駿等【16】通過對小鼠靜脈注射C48/80及吐溫80，觀察其行為學(xué)特征及測定血液組胺、β-氨基己糖苷酶及類胰蛋白酶等指標(biāo)，建立了小鼠全身類過敏試驗(yàn)方法。并通過中藥注射劑及造影劑進(jìn)行了驗(yàn)證，得到了與臨床具有一致性的結(jié)果。因此，此方法可用于類過敏反應(yīng)臨床前檢測及評價(jià)。梁愛華等【17】以小鼠為受試動物，一次性靜脈注射含0.4%的伊文思藍(lán)陽性對照物質(zhì)組胺和C48/80，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)較為明顯的血管通透性增高，且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明小鼠主要的類過敏反應(yīng)特征為血管通透性增高。該研究還利用臨床上報(bào)道發(fā)生類過敏反應(yīng)較多的多種中、西藥注射劑加以驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)此方法用于類過敏反應(yīng)的評價(jià)敏感性高，臨床一致性好。李春英等【10】以吐溫80、含不同濃度吐溫-80的魚腥草蒸餾液和雙黃連粉針劑一次性靜脈注射給與小鼠，發(fā)現(xiàn)給藥后均未見小鼠全身的異常反應(yīng)，但耳廓血管反應(yīng)明顯，且呈現(xiàn)劑量依賴性。因此，可利用小鼠血管通透性增加的特點(diǎn)對臨床上的類過敏反應(yīng)進(jìn)行檢測和評價(jià)。閆位娟等【7】對小鼠一次性尾靜脈注射陽性物質(zhì)及中藥注射劑，通過觀察小鼠行為異常及組胺含量變化進(jìn)行綜合判斷。結(jié)果顯示，小鼠由于個(gè)體小，行為表現(xiàn)不典型，認(rèn)為觀察不準(zhǔn)確等容易導(dǎo)致誤判。因此，作者認(rèn)為小鼠作為類過敏反應(yīng)檢測的動物模型不理想。

綜上，對于小鼠作為評價(jià)類過敏反應(yīng)的動物模型，將血管通透性作為評價(jià)指標(biāo)的研究結(jié)果大多認(rèn)為敏感性及臨床一致性較好。將行為學(xué)異常及組胺作為評價(jià)指標(biāo)的研究報(bào)道不一，有待進(jìn)一步研究。

2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究：

隨著科學(xué)的進(jìn)步和動物福利保護(hù)呼聲的日益高漲，替代或減少整體動物實(shí)驗(yàn)勢在必行，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比整體動物實(shí)驗(yàn)更簡單易行。目前應(yīng)用于類過敏方向研究的細(xì)胞主要有大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞（RBL-2H3）、小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞（P815）、人外周嗜堿性白血病細(xì)胞（Ku812）和大鼠腹腔肥大細(xì)胞（RPMC）等。不同細(xì)胞模型有各自特點(diǎn)，下面逐一進(jìn)行贅述。

2.1 RBL-2H3模型：

RBL-2H3細(xì)胞是從Wistar大鼠保持腫瘤狀態(tài)的嗜堿性白血病細(xì)胞中分離出來的，其包質(zhì)內(nèi)含有很多嗜堿性顆粒，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生過敏或類過敏反應(yīng)時(shí)會引起細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象，進(jìn)而釋放組胺和β-氨基己糖苷酶等物質(zhì)，通過這些物質(zhì)對過敏及類過敏反應(yīng)進(jìn)行判斷。羅霞等【18】將臨床報(bào)道出現(xiàn)類似過敏樣反應(yīng)較多的幾種中藥注射劑與RBL-2H3細(xì)胞于體外共同培養(yǎng)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及測量組胺等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行判斷，提示RBL-2H3細(xì)胞有應(yīng)用于類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的潛在價(jià)值。熊克朝等[29]將不同濃度C48/80方法分別與RBL-2H3細(xì)胞作用不同時(shí)間，通過檢測組胺、類胰蛋白酶和β-氨基己糖苷酶的釋放率及細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)最佳指標(biāo)為組胺和β-氨基己糖苷酶釋放率，最佳作用時(shí)間是30min。因此，可通過此方法對臨床報(bào)道較多的易發(fā)生類過敏反應(yīng)的藥物進(jìn)行類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)。易娟娟等【20】亦以C48/80為工具藥，對RBL-2H3細(xì)胞應(yīng)用于藥物類過敏反應(yīng)評價(jià)的方法學(xué)進(jìn)行研究。得出RBL-2H3細(xì)胞作為體外評價(jià)藥物類過敏反應(yīng)模型具有方便、靈敏和快速的特點(diǎn)，適用于藥物類過敏反應(yīng)的臨床前評價(jià)。范姍姍等【21】亦以C48/80為工具藥，以實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)檢測其對RBL-2H3細(xì)胞生長的影響，另通過檢測組胺及β-氨基己糖苷酶釋放率對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒情況加以驗(yàn)證。建立了基于實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)的可用于類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的細(xì)胞模型。

綜上，RBL-2H3細(xì)胞作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的體外細(xì)胞模型具有操作簡單、結(jié)果靈敏等特點(diǎn)，用于類過敏反應(yīng)的篩查具有可行性，符合動物福利。

2.2 P815和Ku812模型：

P815細(xì)胞系小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞，來源于小鼠肥大細(xì)胞系，其可彌補(bǔ)RBL-2H3細(xì)胞不完全代表肥大細(xì)胞的不足。Ku812細(xì)胞系人外周嗜堿性白血病細(xì)胞，來源于慢性髓性白血病患者爆發(fā)起外周血建立起的細(xì)胞株。李偉等【22】以C48/80為工具藥分別與三種細(xì)胞（RBL-2H3、P815、Ku812）共同培養(yǎng)30min和60min，通過測定Annexin V陽性細(xì)胞率、β-氨基己糖苷酶釋放率等指標(biāo)指示類過敏反應(yīng)的發(fā)生。用聚山梨酯80進(jìn)行適用性考察，發(fā)現(xiàn)P815和Ku812細(xì)胞模型更敏感、穩(wěn)定，適合用于類過敏反應(yīng)的早期篩選。高婕等【23】通過比較三種細(xì)胞（RBL-2H3、P815、Ku812）經(jīng)C48/80刺激后發(fā)生細(xì)胞脫顆粒及相關(guān)指標(biāo)的差異，尋找適合類過敏反應(yīng)評價(jià)的最佳體外細(xì)胞模型。結(jié)果顯示，P815細(xì)胞相比于其他兩種細(xì)胞發(fā)生脫顆粒現(xiàn)象速度快、程度更高，提示其具有應(yīng)用于細(xì)胞模型進(jìn)行類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的潛在價(jià)值。

綜上，目前關(guān)于Ku812細(xì)胞作為類過敏細(xì)胞模型進(jìn)行類過敏檢測的研究尚不充分，較多研究結(jié)果顯示P815細(xì)胞更適合作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的體外細(xì)胞模型。

2.3 RPMC模型：

RPMC細(xì)胞系大鼠腹腔肥大細(xì)胞，來源于大鼠腹腔，具有肥大細(xì)胞生物學(xué)特征，彌補(bǔ)了P815細(xì)胞代表肥大細(xì)胞的不足。關(guān)于RPMC細(xì)胞的研究相對較少，但研究結(jié)果較為一致，均認(rèn)為RPMC細(xì)胞可作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的體外細(xì)胞模型，但反應(yīng)細(xì)胞脫顆粒的方式有的選用細(xì)胞的形態(tài)改變，有的選用β-氨基己糖苷酶等生化指標(biāo)，具體哪一種方法更能準(zhǔn)確的反映細(xì)胞脫顆粒情況有待進(jìn)一步研究。

3 總結(jié)與展望：

隨著中藥注射劑臨床應(yīng)用的日益廣泛，其發(fā)生的不良反應(yīng)備受關(guān)注，其中類過敏反應(yīng)尤為突出。迄今為止，尚無統(tǒng)一的類過敏反應(yīng)檢測模型，本文對過去幾年對整體動物及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)行了綜述，旨在為臨床預(yù)防類過敏反應(yīng)的發(fā)生提供指導(dǎo)。

整體動物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：Beagle犬能夠表現(xiàn)出與人類極為相似的行為學(xué)癥狀及極為敏感的生化指標(biāo)，普遍認(rèn)為Beagle犬模型是用于類過敏反應(yīng)評價(jià)的最佳模型 小型豬由于對脂質(zhì)體敏感，建議用于對脂質(zhì)體的類過敏反應(yīng)進(jìn)行檢測 關(guān)于豚鼠和小鼠行為學(xué)特征及生化指標(biāo)的報(bào)道結(jié)果不一，有待進(jìn)一步研究，但其血管通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，且呈現(xiàn)劑量依賴性，建議豚鼠和小鼠基于血管通透性的研究可用于類過敏反應(yīng)監(jiān)測的模型 關(guān)于大鼠研究較多的是皮膚類過敏試驗(yàn)，結(jié)果敏感性好，可作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的實(shí)驗(yàn)動物模型。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：幾乎所有研究認(rèn)為RBL-2H3細(xì)胞作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的體外細(xì)胞模型具有操作方便、敏感型好，易實(shí)施，符合動物福利 Ku812細(xì)胞相關(guān)研究較少，有待開展更多研究 有研究認(rèn)為P815細(xì)胞在發(fā)生類過敏反應(yīng)時(shí)生化指標(biāo)變化快，且敏感，適合用作類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的體外細(xì)胞模型 RPMC細(xì)胞相關(guān)研究亦不多，但均認(rèn)為其可作為類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的體外細(xì)胞模型，但因該細(xì)胞很難分離純化，用生化指標(biāo)來反映細(xì)胞脫顆粒率會有較大誤差，建議用細(xì)胞形態(tài)改變間接計(jì)算細(xì)胞脫顆粒率。

總之，不同模型檢測指標(biāo)可能不同，敏感性可能不同，適用范圍也可能不同。因此，需開展更多、更深入的研究，確定類過敏反應(yīng)發(fā)生的途徑及機(jī)制，盡快找到能夠更穩(wěn)定、更準(zhǔn)確的用于類過敏反應(yīng)臨床前評價(jià)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停龠M(jìn)中藥注射劑發(fā)展的同時(shí)減少臨床用藥中類過敏反應(yīng)的發(fā)生。