內毒素對妊娠小鼠子宮內巨噬細胞的影響

王婷婷 胡萍 張順利

摘要：研究了內毒素對妊娠小鼠子宮內巨噬細胞的數量和分布的影響，以探討巨噬細胞對胚胎的著床和維持的作用。采用昆明系妊娠小鼠分為對照組和試驗組，在小鼠妊娠6 d（D6）對照組腹腔注射生理鹽水，試驗組分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，分別注射1、2、4 μg劑量的內毒素，用酶組織化學染色的方法顯示出子宮內巨噬細胞的數量和分布。結果顯示，與對照組相比較，試驗Ⅰ、Ⅲ組子宮內巨噬細胞的數量明顯增多，差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組沒有顯著差異。巨噬細胞在子宮環肌外層、環肌內層和內膜上的分布與對照組相比較，環肌外層巨噬細胞數量減少，而環肌內層和內膜的巨噬細胞數量明顯增多，差異顯著。提示內毒素使妊娠小鼠子宮內巨噬細胞數量增多，細胞向子宮內膜遷移，而不利于胚胎著床和維持，可能對母胎免疫耐受產生影響。

關鍵詞：內毒素;妊娠小鼠;酶組織化學;巨噬細胞;免疫耐受

中圖分類號：S852.2 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0193-03

妊娠是一個復雜的生理過程，從免疫學上來看類似于器官移植。胚胎對母體來說是一個移植物，母體免疫系統對此進行識別，并產生免疫應答[1]。巨噬細胞是子宮內的一種重要免疫細胞，有多種表面標志和標記酶，具有抗感染、抗腫瘤、呈遞抗原和免疫調節等作用。巨噬細胞的數量和在子宮內的分布在胚胎的著床和維持中起到一定的作用[2-3]。

內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復合物，可刺激機體對多糖成分產生抗體[4]。內毒素作為外源性致熱原（熱原質），作用于中性白細胞、單核細胞、巨噬細胞等。內毒素能夠激活妊娠小鼠子宮內的巨噬細胞，從而對胚胎的著床和維持產生影響[5]，也對母胎免疫耐受產生一定的影響。

本試驗通過給妊娠期小鼠注射不同劑量的內毒素，通過酶組織化學染色方法，研究內毒素對妊娠小鼠子宮內巨噬細胞的影響，探討巨噬細胞在胚胎的著床和維持中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物[6] 成年雌性昆明種小鼠40只，由河南師范大學生命科學學院實驗動物繁育中心提供，體質量（25±2） g，自由飲水取食。分成對照組與試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，雌、雄鼠按2 ∶ 1合籠，次日晨查見陰栓者為妊娠1 d，到妊娠6 d（D6）時，對照組腹腔注射生理鹽水，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別注射 1、2、4 μg劑量的內毒素，8 d（D8）觀察流產情況并取材。

1.1.2 主要化學藥品和試劑 內毒素，購自Sigma公司;α-醋酸萘酯（α-NAE），購自上海試劑一廠;固藍B鹽購自德國Chroma-gesellschaft公司;其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 冰凍切片機（美國Reichert Histo Stat Microtome Cryostat），柯達DC 290數碼相機。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮材料的獲取 小鼠脫頸椎處死，沿腹中線剪開腹腔，取其子宮，在預冷的生理鹽水中快速去除脂肪，迅速放入液氮中冷凍30 s。標記好材料放入-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 冰凍切片的制備 -20 ℃下冰水包埋材料，修塊，切片，切片的厚度8 μm，材料平鋪在載玻片上，涼干后-20 ℃冰箱冷凍保藏。

1.2.3 0.2 mol/L PBS鹽溶液配制 A液：NaH2PO4·2H2O 3.12 g加100 mL蒸餾水;B液：Na2HPO4·12H2O 7.16 g加100 mL蒸餾水;取A液13 mL加B液87 mL，混合均勻，調pH值至7.4。

1.2.4 孵育液配制 0.03 g α-醋酸萘酯+5 mL丙酮充分溶解+5 mL蒸餾水混勻+20 mL PBS鹽溶液（要邊加邊搖晃防止生成沉淀）+固藍B鹽。充分攪拌溶解混勻。注意孵育液要即配即用。

1.2.5 酶組織化學染色 （1）把冰凍切片室溫下充分干燥。（2）放入純丙酮液中固定10 min。（3）取出固定好的切片用0.2 mol/L的PBS鹽溶液沖洗3次，每次5 min。（4）把沖洗好的切片放入配制好的孵育液中，37 ℃溫浴鍋孵育50 min。（5）從孵育液中取出切片，用0.2 mol/L PBS鹽溶液沖洗1次，5 min。放入0.2 mol/L PBS鹽溶液中浸泡5 min，再放入蒸餾水中浸泡2 min，取出后甘油明膠封片。（6）鏡檢、拍照、統計分析。

1.2.6 統計方法 采用χ2檢驗，α=0.05，結果大于α差異不顯著，小于α差異顯著。2 結果與分析

2.1 酶組織化學染色巨噬細胞的結果

鏡檢觀察子宮內巨噬細胞，發現巨噬細胞多為不規則形狀，也有呈橢圓形、圓形的，染色結果細胞質呈紫色，而細胞核為無色（圖1）。

2.2 內毒素對妊娠小鼠胚胎著床的影響

正常小鼠的胚胎為粉紅色，透明度較高。注射內毒素后能誘使胚胎流產，先出現陰道出血，然后出現胚胎吸收。對照組未觀察到流產，胚胎為粉紅色;試驗Ⅰ組小鼠未見流產，但發現子宮內有黑紅色的瘀血;試驗Ⅱ、Ⅲ組流產率分別為75%和100%，胚胎已經模糊不清，出現吸收現象（表1）。

2.3 內毒素對妊娠小鼠子宮內巨噬細胞數量的影響

注射不同劑量的內毒素使妊娠小鼠子宮內巨噬細胞的總數呈波動性變化，注射1 μg內毒素巨噬細胞數量較正常對照組明顯增加，2 μg時數量又下降到正常水平，4 μg時數量又增加（圖2）。

妊娠小鼠子宮內巨噬細胞的總體數量變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異不顯著（表2）。

2.4 內毒素對妊娠小鼠子宮內巨噬細胞分布的影響

妊娠小鼠子宮內膜巨噬細胞數量分布的變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異不顯著（表3）。

妊娠小鼠子宮內環肌層巨噬細胞的數量分布變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異顯著（表4）。

妊娠小鼠子宮內環肌外層巨噬細胞的數量分布變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異顯著（表5）。

注射不同劑量的內毒素使妊娠小鼠子宮內巨噬細胞的數量分布發生變化。隨著注射內毒素劑量的逐漸增加，環肌內層和內膜的細胞數量增加， 環肌外層細胞數量減少。正常情況下，巨噬細胞大多數分布于子宮外膜，注射內毒素刺激環肌內層和內膜的巨噬細胞數量增加。雖然試驗Ⅱ組妊娠小鼠子宮內巨噬細胞總數量沒有變化，但巨噬細胞在子宮內的分布與對照組相比環肌內層的數量明顯增多（圖3）。

3 討論

文獻報道非特異性酯酶α-NAE存在于單核細胞、粒細胞系統中，而子宮內的其他細胞幾乎不含此物質[7]，本研究觀察子宮內巨噬細胞，發現巨噬細胞多為不規則形狀，也有呈橢圓形、梭形。α-NAE主要存在于巨噬細胞的細胞質內，染色結果細胞質呈紫色，而細胞核為無色。用此方法可以很簡便很快速地顯示陽性巨噬細胞，與組化染色相比很經濟，但也有一定的缺點，比如染色很容易褪色、不易長時間保存。

有文獻報道在妊娠期D8肌層中幾乎沒有巨噬細胞[8]，本研究也觀察到相同的結果，所以在對巨噬細胞進行統計計數時把子宮結構分為環肌外層、環肌內層和內膜進行統計分析。

研究發現，1 μg內毒素能使小鼠巨噬細胞數量增加，使小鼠子宮內膜、肌層的巨噬細胞都與對照有顯著性差異，但是隨著內毒素劑量的增加，到2 μg時，子宮總的巨噬細胞基本沒有變化，但是肌層巨噬細胞和對照相比有了顯著性差異。4 μg 時，全部的孕鼠均發生了流產，但總的子宮巨噬細胞數量和1 μg沒有顯著性差異。但是同樣，流產小鼠子宮內膜和肌層的巨噬細胞都與對照有顯著性差異。由此，推測子宮內巨噬細胞數量的多少和LPS的用量有關。在一定的LPS范圍內，巨噬細胞的數量隨LPS劑量增加而減少到一定水平，但是當LPS量繼續增大時，巨噬細胞的數量將會增多。

小鼠在正常妊娠期間子宮內巨噬細胞的數量分布隨時間不斷地發生動態變化，在小鼠妊娠D8子宮內的巨噬細胞主要集中在子宮的環肌外層，而環肌內層和內膜中幾乎沒有巨噬細胞，有利于胚胎著床和維持。妊娠期子宮內巨噬細胞過多存在對于妊娠不利[9]。本研究也觀察到了這種現象，但是試驗還觀察到了2 μg劑量巨噬細胞總數基本沒有變化，但是在子宮內部的分布卻發生了變化，也就是說巨噬細胞在子宮內發生了遷移，從而導致流產。

但內毒素是如何調節巨噬細胞的遷移呢？試驗組與對照組相比巨噬細胞的數量明顯增加，而且巨噬細胞在子宮環肌內層和內膜的分布數量也明顯增加，試驗Ⅱ組雖然巨噬細胞數量又降到正常的水平，但巨噬細胞分布在環肌內層的數量也明顯增加。

內毒素并不干擾孕鼠的正常內分泌功能，也不能穿越胎盤進入胎兒體內。內毒素誘導流產的一個重要機制是引起預致敏的（primed）巨噬細胞釋放TNF-α[10-12]。TNF-α導致流產已被動物試驗所證實，內毒素誘導小鼠流產與子宮內TNF-α的產生有直接關系，本試驗中內毒素能誘導巨噬細胞由子宮外膜向子宮內膜發生遷移，使子宮內膜巨噬細胞數量增加，推測遷移到內膜的巨噬細胞釋放TNF-α。它可直接引起胎盤滋養層細胞的凋亡，因滋養層前祖細胞在未成熟階段發生程序性死亡而耗竭，導致子宮內胎兒缺乏營養而死亡[13]。使妊娠小鼠子宮內的胚胎不能正常著床和維持，可能不利于母胎免疫耐受，使母鼠對胚胎產生排斥而流產，所以內毒素能激活巨噬細胞，使巨噬細胞數量增加，并誘導巨噬細胞向子宮內發生遷移，影響胚胎的著床和維持，導致妊娠小鼠流產。

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