一株高產淀粉酶放線菌的篩選鑒定及產酶條件優化

袁春營 孟陽 吳佩佩

摘要：利用透明圈法和搖瓶發酵法從對蝦養殖池塘底泥中篩選出1株淀粉酶高產菌株，掃描電子顯微鏡觀察菌株的亞顯微形態，生化方法測定了菌株的生理生化指標，分子生物學方法分析了菌株的16S rRNA序列，同時響應面法優化了該菌株的產酶條件。結果表明，根據菌株的亞顯微形態、生理生化特征和16S rRNA序列比對，確定該菌株為盧森坦擬諾卡氏菌（Nocardiopsis lucentensis）;該菌株的最適產酶條件為初始pH值8.8、鹽度60‰、溫度40 ℃。篩選到的淀粉酶高產菌株，能夠為工業生產提供耐鹽堿淀粉酶儲備菌株。

關鍵詞：淀粉酶;盧森坦擬諾卡氏菌;亞星微形態;生理生化特征;RNA序列對比;產酶條件;響應法

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0288-04

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一類酶的統稱，其產量約占工業酶總產量的85%以上。淀粉酶在食品、焙烤、發酵、紡織、輕工業、畜牧業生產及醫藥產業中得到廣泛應用[1-5]。但是在工業化生產中高鹽、堿性等嚴苛條件制約著淀粉酶的應用。在此條件下，淀粉酶的穩定性下降，酶活力大幅度損失或者完全喪失，因此開發具有高穩定性的生物酶，使其能夠適應高鹽、堿性等工業環境，成為近年來亟待解決的重要難題。嗜鹽細菌對外界自然環境的鹽度具有極強的適應性，是一類重要的極端微生物資源。嗜鹽菌可以在較高的鹽度環境中生長，其最適鹽濃度一般為0.5%～36.0%[6]。為了適應高鹽度環境，這類細菌產生的各種酶往往具有一些獨特的生物學特性，如耐鹽、耐高或低pH值、耐堿等。因此，篩選高效耐鹽堿淀粉酶產生菌株，并將其應用于工業化生產，具有重要的科學意義與實踐價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株從天津市漢沽南美白對蝦養殖池塘底泥中篩選得到。

1.1.1 培養基 改良察氏培養基：NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4 0.01 g、可溶性淀粉30.00 g、蒸餾水1.00 L，pH值7.2～7.4，固體培養基添加瓊脂粉1.8%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。改良LB培養基：蛋白胨10 g、NaCl 15 g、可溶性淀粉10 g、蒸餾水1 L，pH值 7.2～7.4，固體培養基添加瓊脂粉1.8%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;化學試劑均為分析純，購自北京索來寶生物科技有限公司。

1.1.2 試驗儀器 立式雙層小容量恒溫培養搖床（上海新苗醫療器械制造有限公司）;全溫型多振幅軌道搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）; 立式蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）;PCR擴增儀（美國伯樂公司）;高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）;精密pH計（天津市盛邦科學儀器技術開發有限公司）;CO2培養箱（美國Thermo公司）;電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 淀粉酶產生菌株的篩選 取1 g池塘底泥，加入已滅菌的100 mL察氏培養基中，于30 ℃、120 r/min下恒溫振蕩富集培養，3 d后取5 mL培養液，轉接至察氏培養基中，相同條件培養3 d。

無菌條件下對富集培養液進行梯度稀釋，并在固體察氏培養基上進行涂布，30 ℃培養，3 d后在平板上滴數滴碘液，選取透明圈明顯的菌株進行平板劃線分離純化。經過復篩，獲得淀粉酶高產菌株，編號為EPM。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株的形態學特征 菌株純化后接種到察氏培養基中，30 ℃恒溫培養3 d，革蘭氏染色觀察菌體的顯微形態，掃描電鏡下觀察菌體的亞顯微形態。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析 試劑盒法提取細菌總DNA，16S rRNA通用引物（27F和1 495R）進行PCR擴增，反應體系（50 μL）為10×Buffer 5.0 μL;dNTPs 4.0 μL;27F 1.0 μL;1492R 1.0 μL;Taq酶0.5 μL;DNA模板2.0 μL;蒸餾水 36.5 μL。擴增程序為預變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃維持10 min。

PCR產物送交北京奧科生物技術有限責任公司測序，所得序列提交GenBank數據庫，并進行Blast分析比對。

1.2.3 淀粉酶活性的測定 3，5-二硝基水楊酸試劑顯色法測定淀粉酶活性[7]。以0.1 μL粗酶液，1 min水解淀粉產生相當于1 μg葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.2.4 菌株EPM產酶條件優化 中心組合Box-Behnken優化試驗，pH值、溫度及鹽度為自變量，以淀粉酶活性為響應值（Y），探討3個因素對淀粉酶活性的影響，試驗因素與設計見表1。

2 結果與分析

2.1 菌株EPM的篩選

從對蝦養殖池塘底泥中篩選到透明圈直徑較大的淀粉酶高產菌株EPM。由圖1可知，此菌株產生的淀粉酶活性較高，菌株菌落為白色、不透明、圓形、邊緣粗糙，生長過程中會產生抗生素藥物的氣味。

2.2 菌株EPM的鑒定

2.2.1 菌株的生理生化特征 菌株EPM的生理生化指標測定結果見表2。菌株EPM能夠利用葡萄糖，不能利用乳糖，甲基紅與靛基質試驗為陰性，V-P試驗為陽性，不產生硫化氫，不利用檸檬酸鹽，可還原硝酸鹽，能夠形成菌膜，為革蘭氏陽性菌。

2.2.2 菌株EPM的亞顯微觀察 由圖2可知，掃描電鏡下觀察，菌株菌絲呈多層纖維狀結構，菌絲寬度為0.5～1.0 μm，有些會斷裂為短桿狀。

2.2.3 菌株EPM的16S rRNA序列分析 用DNA純化試劑盒對所提取的DNA進行純化后，用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖電泳圖譜如圖3所示。對PCR產物進行測序，將所得序列輸入GenBank中，與NCBI中Microbial Nucleotide Blast進行比對，盧森坦擬諾卡氏菌（Nocardiopsis lucentensis）與此序列同源性最高，達99%。

結合以上EPM的菌落形態、菌株的亞顯微形態、菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析，確定篩選到的菌株為盧森坦擬諾卡氏菌。

2.3 菌株的產酶條件優化

按照表1設計方案進行響應面試驗，結果見表3。

采用Design expert 7.0軟件對上述結果進行數據整理和分析，二次回歸模型進行擬合，回歸分析結果見表4、表5及表6。

P值小于0.05，表示該項指標顯著，從表4可以看出，模型的P值小于0.05，說明該模型顯著，一次項中A、B的P值均小于0.05，說明它們對響應值的影響顯著，二次項中A2、B2、C2的P值均小于0.05，說明所選3個因素的二次項對響應值影響顯著。表4的P值表明，在所選定的各因素水平范圍內，對響應值的影響排序為溫度>鹽度>pH值。

回歸模型中失擬項的P值大于0.05（表5），說明失擬項不顯著，所選模型與實際情況擬合程度高，不需要引入更高次數的項，模型適當。

回歸模型的復相關系數為0.960 3，校正相關系數為 0.889 0（表6），達到了較好水平，說明模型的預測值和實測值擬合較好，信噪比較大，說明這個模型能較好地反映試驗結果。

最終擬合得到的二次回歸方程為Y=1.350 0-0.160 0A-0.140 0B+0.005 7C-0.100 0AB-0.089 0AC-0.096 0BC-0.600 0A2-0.290 0B2-0.330 0C2。

由響應面回歸分析和回歸方程擬合，繪出響應面分析圖，見圖4至圖6。

從圖4可以看出，隨著pH值和溫度的升高，酶活性也隨之增大，當pH值和溫度升高到一定程度時，酶活性達到最大，pH值和溫度繼續升高時，酶活性又會隨之下降，說明pH值和溫度取某個適中值時，酶活性達到最大。同理，從圖5、圖6可以發現，pH值和鹽度、溫度和鹽度同樣對酶活性是非線性的，對酶活性同樣存在二次項。通過軟件優化、模擬得到最佳產酶條件為pH值8.8、溫度39.19 ℃、鹽度60.32‰，預測的淀粉酶活性為1.332 U/μL， 經3次驗證試驗， 實際測得淀粉酶活性為 1.356 U/μL?？紤]到操作的便利，將培養條件修正為pH值 8.8、溫度40 ℃、鹽度60‰，在此條件下進行驗證，實際測得淀粉酶活性為1.349 U/μL，驗證試驗和修正試驗所得淀粉酶活性與理論值相差很小，說明采用響應面法優化得到的產酶條件參數準確可靠，模型具有較高的應用價值。

3 討論

擬諾卡氏菌是一種重要的資源微生物。一些學者在擬諾卡氏菌資源收集、生態學及天然產物等方面開展了較多研究工作，探索了擬諾卡氏菌地理分布格局、適應極端環境機制，分離到多種化學結構豐富、活性新穎的新化合物，以及可降解淀粉、蛋白質、纖維素和木聚糖等生物大分子的具有耐冷、耐堿或耐熱等特殊性質的酶[8-9]。筆者所在課題組從南美白對蝦養殖池底泥中篩選到1株高產淀粉酶菌株，經過系列生理生化特征及16S rRNA序列分析，確定該菌株為盧森坦擬諾卡氏菌。

中度嗜鹽菌因其具有較大的鹽度適應性，并應用廣泛，引起了人們的極大關注。1978年，Kushner對中度嗜鹽菌定義為在0.5 mol/L（約3%）～2.5 mol/L（約15%）NaCl濃度之間有最佳生長的細菌[10]。1993年，Ramos-Cormenzana將中度嗜鹽菌定義為在5%～20%鹽度范圍內能夠最佳生長的細菌[11]。中度嗜鹽菌在降解有毒化合物、環境污染治理等方面有重要的應用前景[12-13];中度嗜鹽菌產生的酶如淀粉酶、核酸酶、蛋白酶等能夠抑制某些植物病原真菌，還可用于實際生產生活中[14]。

本研究從對蝦養殖池底泥中篩選到盧森坦擬諾卡氏菌，其淀粉酶活性達1 000 U/mL以上，高于芽孢桿菌屬菌株產生的淀粉酶活性（293.8 U/mL）[15]，后者的最適鹽度為50‰，屬于中度嗜鹽菌。通過響應面法，筆者所在課題組優化了盧森坦擬諾卡氏菌的產酶條件，最適鹽度為60‰，pH值為8.8，說明該菌株在鹽度較高、堿度較大的環境中具有較好的淀粉酶產生能力，預示著該菌株在高鹽高堿的環境中具有較大的應用前景，可應用于工業、食品和污水處理等方面。

參考文獻：

[1]Marc J E C van der Maarel，Veen B V D，Uitdehaag J C M，et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family[J]. Journal of Biotechnology，2002，94（2）：137-155.

[2]Sivaramakrishnan S，Gangadharan D，Nampoothiri K M，et al.α-amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J]. Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：173-184.

[3]Asgher M，Asad M J，Rahman S U，et al. A thermostable α-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing[J]. Journal of Food Engineering，2007，79（3）：950-955.

[4]樓 超，劉鐵帥，賈博深，等. 高產淀粉酶菌株的篩選及產酶條件優化的探究[J]. 中國衛生檢驗雜志，2010，20（11）：2817-2820.

[5]Zoe K，Mariaia L K. Thermostable α-amylase production by Bacillus subtilis entrapped in calcium alginate gel capsules[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，39（4）：690-696.

[6]Ventosa A，Nieto J J，Oren A，et al.Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62（2）：504-544.

[7]林加涵，魏文鈴，彭宣憲. 現代生物學實驗[M]. 北京：高等教育出版社，2001，5-7.

[8]王飛飛. 沙漠土壤擬諾卡氏菌次級代謝產物的研究[D]. 北京：北京協和醫學院，2014.

[9]吳少杰，馬桂珍，王淑軍，等. 一種海洋擬諾卡氏菌產生的胞內中性β-葡萄糖苷酶[J]. 海洋科學，2013，37（4）：41-46.

[10]Kushner D J. Life in high salt and solute concentrations：halophilic bacteria[M]. London：Microbial Life in Extreme Environments，1978：317-368.

[11]Ramos-Cormenzana A. Ecology of moderately halophilic bacteria[M]. Boca Raton：The Biology of Halophilic Bacteria，1993：55-86.

[12]Lefevre E，Round L A. A preliminary report upon some halophilic bacteria[J]. Journal of Bacteriology，1919，4（2）：177-182.

[13]Bajpai P. Microbial degradation of pollutions in pulp mill effluents[J]. Advances in Applied Microbiology，2001，48（48）：79-134.

[14]Gupta S，Kuhad R C，Bhushan B，et al. Improved xylanase production from a haloalkalophilic Staphylococcus sp. SG-13 using inexpensive agricultural residues[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2001，17（1）：5-8.

[15]曹廷鋒，肖 靜，侯運華，等. 一株高產淀粉酶嗜鹽海洋菌的篩選鑒定及其發酵條件研究[J]. 中國釀造，2011，30（10）：86-90.