含腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌的高密度發酵和免疫效果

彭小兵 杜吉革 彭國瑞

摘要：為確定含腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素重組蛋白的生產效率并評價其作為抗原的免疫效果，用生物反應器對重組大腸桿菌DE3-pET-AE進行高密度發酵，并將其制苗后以不同抗原劑量分別接種家兔和綿羊，間隔21 d進行二免，分別測定一免、二免動物混合血清的中和效價。發酵結果顯示，培養物菌體密度D600 nm達20.3，相對表達量為27.6%，D600 nm與相對表達量的乘積為搖瓶培養的6.5倍，菌體濕質量為37.2 g/L;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果顯示，目的蛋白以可溶形式表達。動物免疫效果評價結果顯示，在家兔和綿羊上，抗原含量與免疫效果在一定的范圍內均呈正相關，當接種量為300 μg/只時，免疫效果均最好;對腐敗梭菌毒素與D型產氣莢膜梭菌毒素的血清中和效價，在家兔上一免、二免分別達4與30、15與200，在綿羊上一免、二免分別達2與30、12與250。結果表明，DE3-pET-AE菌高密度發酵可獲得高產量蛋白抗原，且抗原的免疫效果明顯優于《中華人民共和國獸藥典》合格標準。

關鍵詞：腐敗梭菌α毒素;產氣莢膜梭菌ε毒素;大腸桿菌高密度發酵;免疫效果;抗原含量;家兔;綿羊

中圖分類號：S852.4+3 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0186-03

羊快疫和腸毒血癥是分別由腐敗梭菌和D型產氣莢膜梭菌引起綿羊和山羊發生急性死亡的2種重要梭菌性疾病[1]，因發病急導致無法及時治療，給養羊業造成重大損失，故免疫接種是預防該病的最有效途徑。然而，國內現有用于預防該病的疫苗（如羊快疫、黑疫二聯滅活疫苗與羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯四防滅活疫苗及羊梭菌病多聯干粉滅活疫苗等）的檢驗合格率并不高[2]。因此，一方面通過研制產毒培養基配方、改善發酵工藝進而提高抗原含量是提高傳統疫苗免疫效果的有效途徑之一;另一方面，通過基因工程方法研制亞單位疫苗也成為解決現有疫苗質量不高的另一重要候選途徑。腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素分別是腐敗梭菌和D型產氣莢膜梭菌最主要的致死性毒力因子和保護性抗原，通過大腸桿菌表達系統分別獲得這2種重組毒素蛋白，經制苗后免疫動物均可產生有效的免疫保護[3-5]。

鑒于此，本試驗對已構建的同時含有腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌進行高密度發酵，以檢測重組蛋白的生產效率。隨后，將發酵產物制苗后免疫接種家兔和綿羊并檢測血清中和效價，以評價發酵抗原的免疫效果，進而為研發亞單位疫苗積累數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 含腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌DE3-pET-AE，由筆者所在實驗室構建并保存。

1.1.2 試驗用動物 綿羊，5～6月齡，品種為小尾寒羊，購自河北保定滿城區誠信養殖場。CD-1（ICR）小鼠，16～20 g，SPF（無特定病原）級;日本大耳白家兔，1.5～2.0 kg，清潔級。小鼠和家兔均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 主要儀器有恒溫搖床（培英，THZ-D型）、電子天平（METTLER TOLEDO，PB203-N型）、紫外分光光度計（SPECTRA max，384 plus）、臺式高速冷凍離心機（KUBOTA，3500型）、生物反應器（Applicon，ez-control & 7 L Autoclavable Bioreactor）等。

1.1.4 主要試劑 腐敗梭菌菌株C55-1株（CVCC60021）外毒素和D型產氣莢膜梭菌C60-3株（CVCC82）外毒素，由筆者所在實驗室制備并保存。α-乳糖，SIGMA公司;酪蛋白胨、酵母浸出物，北京奧博星生物技術有限公司;葡萄糖、無機鹽、甘油，北京化學試劑公司;生理鹽水、明膠緩沖液、葡萄糖溶液等參照《中國獸用生物制品規程》[6]配制。

1.2 方法

1.2.1 重組菌的復蘇 將重組菌DE3-pET-AE劃線接種于LB平板上[添加氨芐青霉素（簡稱Amp+）]，37 ℃培養 12 h。

1.2.2 搖瓶振蕩培養 挑取重組菌單菌落，接種于2 mL MDG[7]（Amp+）非誘導培養基中，37 ℃、260 r/min振搖培養10 h;將全部培養物接種于100 mL ZYM-5052[7]（Amp+）自誘導培養中，30 ℃、260 r/min振搖培養24 h。收獲培養物，測定D600 nm，并進行蛋白電泳，用Quantity One軟件分析靶蛋白的相對表達量。

1.2.3 生物反應器高密度發酵 挑取重組菌單菌落，接種于 4 mL MDG（Amp+）非誘導培養基中，37 ℃、260 r/min振搖培養16 h;將全部培養物接種于200 mL MDG（Amp+）非誘導培養基中，37 ℃、260 r/min振搖培養10 h。將培養物接種于含4 L基礎培養基（Amp+）的生物反應器中進行發酵培養，接種量為4%，發酵溫度為30 ℃，通氣量為10 L/min，攪拌速度為500 r/min，控制pH值為7.0（補堿管接5 mol/L NaOH，補酸管接補料培養基），共培養24 h。在基礎培養基中，C源組分用葡萄糖替換5052（即甘油、葡萄糖和乳糖的混合液），其他組分與ZYM-5052相同。補料培養基包括 10.0%酪蛋白胨、5.0%酵母浸出物、33.3%甘油、13.3%乳糖、0.8% MgSO4·7H2O。培養結束后收獲培養物，測定D600 nm。對發酵后菌液進行10倍稀釋，再經超聲波裂解處理后對全菌、菌體破碎上清和包涵體進行蛋白質電泳，用Quantity One軟件分析靶蛋白的相對表達量。

1.2.4 制苗 取生物反應器培養物，按總體積的0.4%加入甲醛溶液（含40%甲醛），37 ℃滅活48 h。經滅活脫毒檢驗合格后，以抗原、鋁膠比例為4 ∶ 1來制備疫苗，使靶蛋白的終濃度為300 μg/mL。

1.2.5 疫苗在家兔上的免疫效果研究 免疫前在每只家兔耳中動脈采血5 mL，分離血清，按《中華人民共和國獸藥典》[8]的方法測定血清對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。血清效價是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD（最小致死量）數”。將疫苗用20%鋁膠鹽水（含200 g氫氧化鋁膠和800 mL0.85%NaCl）稀釋后，分別以300、150、75、37.5 μg的劑量皮下注射家兔各5只，免疫后21 d進行第2次免疫（免疫劑量及接種方式同首免），首免后21、35 d對每只家兔進行耳中動脈采血5 mL，分離血清，測定每組5只家兔混合血清分別對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。

1.2.6 疫苗在綿羊上的免疫效果研究 免疫前在每只綿羊頸靜脈采血5 mL，分離血清，按《中華人民共和國獸藥典》[8]的方法測定血清對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。將疫苗用20%鋁膠鹽水稀釋后，分別以300、150、75、37.5 μg的劑量皮下注射綿羊各5只，免疫后21 d進行第2次免疫（免疫劑量及接種方式同首免），首免后21、35 d 對每只綿羊進行頸靜脈采血5 mL，分離血清，測定每組5只綿羊混合血清分別對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。

2 結果與分析

2.1 搖瓶振蕩培養結果

采用搖瓶振蕩培養重組大腸桿菌DE3-pET-AE，30 ℃、260 r/min培養24 h，結果菌體密度D600 nm為4.81，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后用軟件測算得到目的蛋白相對表達量為17.9%，C值（C=D600 nm×相對表達量）為0.86。

2.2 高密度發酵結果

采用生物反應器高密度發酵重組大腸桿菌DE3-pET-AE，30 ℃培養24 h，結果菌體密度D600 nm達20.3，相對表達量為27.6%，C值為5.60，菌體濕質量為37.2 g/L。SDS-PAGE結果見圖1，可見目的蛋白以可溶形式表達。

2.3 疫苗在家兔上的免疫效果

對免疫前家兔血清進行測定，結果對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價均小于1，均為抗體陰性兔。將不同抗原劑量的疫苗分別免疫家兔后，測定每組5只家兔混合血清對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。由表1可知，在一定范圍內抗原劑量與免疫效果呈正相關;一免、二免血清中和效價均達到或顯著高于《中華人民共和國獸藥典》相關產品合格的標準（即血清中和效價對腐敗梭菌毒素應達到1 MLOs/0.1 mL，對D型產氣莢膜梭菌毒素應達到3 MLOs/0.1 mL）[8]。對于腐敗梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的 1～4倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的3～15倍，增至一免效價的2～5倍。對于D型產氣莢膜梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的10倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的17～67倍，增至一免效價的 1.7～6.7倍。提示免疫劑量為300 μg/只時，家兔免疫效果最好，一免血清效價對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素分別可達到《中華人民共和國獸藥典》合格標準的4、10倍，而二免效價則分別可達到《中華人民共和國獸藥典》合格標準的15、67倍。

2.4 疫苗在綿羊上的免疫效果

對免疫前綿羊血清進行測定，結果對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價均小于1，均為抗體陰性綿羊。將不同抗原劑量的疫苗分別免疫綿羊后，測定每組5只綿羊混合血清分別對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。由表2可知，在一定范圍內抗原劑量與免疫效果呈正相關;一免、二免血清中和效價均達到或顯著高于《中華人民共和國獸藥典》相關產品合格的標準（即血清中和效價對腐敗梭菌毒素應達到1 MLDs/0.1 mL，對D型產氣莢膜梭菌毒素應達到3 MLDs/0.1 mL）[8]。對于腐敗梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的 1～4倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的2～12倍，增至一免效價的2～6倍。對于D型產氣莢膜梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的1.7～10.0倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的16.7～83.3倍，增至一免效價的5～10倍。提示免疫劑量為300 μg/只時，綿羊免疫效果最好，一免血清效價對腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素分別可達到《中華人民共和國獸藥典》合格標準的2、6倍，而二免效價則分別可達到《中華人民共和國獸藥典》標準的12、83.3倍。

3 討論

自誘導培養基的原理在于碳源，即大腸桿菌優先使用葡萄糖生長至飽和，當葡萄糖被消耗殆盡時開始使用乳糖（既作為碳源，又作為誘導劑），進而表達目的蛋白[7]。自誘導系統的優點在于重組菌可生長至較高密度，無需人為添加誘導劑，并且用乳糖替代異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）具有無毒且價廉的特點。本研究用自誘導系統進行搖瓶培養，菌體密度D600 nm達到4.81時，遠高于以LB培養至D560 nm為0.5～1.0再加入IPTG誘導的培養方式。影響重組大腸桿菌高密度發酵的主要因素包括宿主菌、接種量、培養基成分、培養方式、培養條件、誘導劑的選擇、補料方式等[9-10]。本研究在借鑒前人經驗和自誘導原理的基礎上，采用生物反應器進行高密度發酵，即先以葡萄糖作為碳源使細菌生長到高密度，再以流加含甘油和乳糖組合的方式誘導目的蛋白表達，結果菌體密度D600 nm達到搖瓶培養的4.2倍，相對表達量達到搖瓶培養的1.5倍，菌體密度和相對表達量的乘積達到搖瓶培養的6.5倍。本研究所采用的高密度發酵策略使重組蛋白產率大大提高，并且其后的動物試驗也證明發酵產物具有良好的免疫效果，此策略可供其他研究者借鑒參考。另外，本研究的發酵產物以可溶性形式表達，將有利于蛋白折疊成天然構象進而露出抗原表位，可能有助于抗原獲得可靠的免疫效果。

本研究首次報道了同時含有腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素基因重組大腸桿菌的高密度發酵工藝，及其產物在家兔和綿羊上的免疫效果。同時表達2種毒素蛋白的優勢在于僅發酵1株大腸桿菌即可達到預防2種疾病的目的。家兔和綿羊試驗結果也表明，重組蛋白免疫效果良好，其誘發機體產生的較好的血清中和效價顯著高于現有《中華人民共和國獸藥典》合格標準[8]，即使低至“每只動物予37.5 μg”的抗原免疫量仍可達到標準。筆者曾報道現有疫苗檢驗合格率不高[2]，并且田間綿羊效價檢測合格率也偏低（數據未報道）。由此推知，靶動物免疫持續期的抗體效價將更難達到合格標準。值得一提的是，國際上羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥類疫苗無論在田間使用還是在替代動物效力檢驗[11-12]上均采用2次免疫。故本研究對二免家兔和綿羊的血清效價均進行了評估，結果顯示2種組分的二免效價均獲得大幅增長，分別提升為《中華人民共和國獸藥典》合格標準的至少12倍和67倍，此結果為我國此類疫病的防控及制品質量評價標準與方法的改進提供了參考依據。綜合一免、二免數據來看，家兔和綿羊獲得最佳效價的抗原劑量相同，且各劑量的家兔效果普遍好于綿羊，推測其原因可能是綿羊體質量相對較大，故需要接種的抗原量更多。

隨著基因工程技術的日益成熟，亞單位疫苗的發展速度也越來越快，本研究結果為羊快疫和腸毒血癥的預防提供了基礎性數據。此外，國內外常將不同的梭菌組分相互聯合或與其他非梭菌組分相聯合制備多聯苗，以達到“一針多防”的目的[8，11-12]。本研究所制備的發酵產物經動物試驗表明，可用于同時預防羊快疫和腸毒血癥，至于將其進一步聯合其他組分制備更多聯疫苗的可行性及組分間的兼容性，仍有待于進一步研究驗證。

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