基于ITS2的北沙參藥材及其偽品的分子鑒定

韓曉偉 曹楸偉 嚴玉平

摘要：利用內部轉錄間隔區2（ITS2）條形碼來鑒定河北某藥材市場北沙參的真偽品，探討分子方法鑒定北沙參藥材真偽品的可行性。提取12份北沙參樣品的DNA，利用ITS2引物進行PCR擴增，對擴增產物進行雙向測序，利用CodonCode Aligner軟件進行序列拼接。從Genbank下載13條北沙參序列，利用MEGA 6.0分析比對25份序列，計算其種間、種內的Kimura雙參數遺傳距離（K2P距離）以及各序列的變異位點并進行聚類分析，利用RNA多重排列（locARNA）來預測北沙參及其偽品的二級結構。12份樣品中10份為北沙參，1份是川明參，1份為祁木香。ITS2序列可以較好地區分北沙參及其偽品，可作為北沙參鑒定的有效方法而加以推廣。北沙參的DNA條形碼鑒定體系的建立，為DNA條形碼技術在臨床及市場監管領域的實踐應用提供了理論基礎。

關鍵詞：北沙參;真偽品;ITS2;DNA條形碼;臨床用藥

中圖分類號： R282.710.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0071-05

北沙參（Glehnia littoralis）為傘形科珊瑚菜的干燥根，為我國常用大宗中藥材之一，臨床上主要用于治療肺燥干咳、熱病傷津等癥[1]。北沙參主產于河北安國、山東萊陽、內蒙赤峰等地[2]，其中河北安國產北沙參為安國八大祁藥之一，以其條粗順直，無杈無須，被譽為“一柱香”，《神農本草經》列其為上品。北沙參作為藥食兩用的藥材，受到廣大消費者喜愛，但是由于市場上常有許多北沙參的混偽品作北沙參來用，因此易產生混淆，從而對臨床用藥安全造成威脅。

一直以來利用理化性質對北沙參進行鑒定是主要的鑒定方式[3-6]，而DNA條形碼鑒定技術的發展為中藥材的鑒定提供了新的工具。陳士林等提出以內部轉錄間隔區2（ITS2）作為藥用植物鑒定的通用序列并在中藥材鑒定方面進行了大量嘗試[7-8]。目前已有利用ITS2對北沙參進行鑒定的報道[9-10]，這些研究主要關注藥材原植物的鑒別或原植物與藥材的混合鑒別。本研究是利用ITS2的序列，對河北某中藥材市場的北沙參藥材進行檢測，為DNA條形碼技術應用于藥材市場的監管和臨床用藥的安全提供理論和實踐的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

12份北沙參藥材的樣品全部購自河北某藥材市場，經河北中醫學院鄭玉光教授鑒定，憑證樣本保存于河北中醫學院藥學院，其余13個樣本來源于GenBank，樣品來源見表1。

1.2 試驗設計

1.2.1 儀器與試劑 Taq酶[寶日醫生物技術（北京）有限公司];PCR儀及凝膠成像系統[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司];核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;離心機（Eppendorf中國）;膠回收試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）;其他均為進口分裝或國產分析純試劑。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，測序工作由華大基因完成。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增和測序 提取北沙參干燥根的基因組DNA，利用通用引物ITS2對所提取的DNA進行PCR擴增，引物序列如下：

ITS2F：5′-ATGCGATA-CTTGGTGTGAAT-3′;

ITS2R：5′-GACGCTTCTCC-AGACTACAAT-3′。

擴增反應體系為50 μL。反應體系按照韓曉偉等的方法[11]配制，PCR完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，每份樣品30 μL PCR產物直接送深圳華大基因公司北京測序部進行測序。每份樣品均進行3次生物學重復。

1.2.3 數據處理 數據處理方法按照韓曉偉等的數據處理方式進行[11]。二級結構預測利用RNA多重排列（locARNA）方式進行。

1.2.4 試驗時間和地點 試驗時間為2017年，試驗地點為河北中醫學院橘泉校區科研樓。

2 結果與分析

2.1 北沙參樣品DNA提取和PCR擴增結果

提取出12份樣品的DNA后，利用ITS2引物進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，12份樣品均能擴出單一明亮的條帶（圖1），隨后將擴增的產物測序。

2.2 序列的比對與提交

將擴增的12份樣品的ITS2序列經CodonCode Aligner軟件校對拼接后，在NCBI網站上進行BLAST比對，結果發現12份樣品中有10份為北沙參，1份為川明參，1份是祁木香。重新進行取樣，提取DNA后擴增測序，結果相同。這說明北沙參藥材中混入了其他品種。將12條序列提交到GenBank數據庫并獲得了登錄號（表1）。

2.3 北沙參樣品序列的分析

北沙參樣品的ITS2序列長度約為227 bp，在確定的10份北沙參樣品中，MG793244有15個變異位點，MG793246和MG793247序列相同，有6個變異位點，說明北沙參存在較明顯的種間變異（圖2）。而MG793249川明參與北沙參的序列差別較大，表明二者從遺傳組成上是有差別的，不可混用。MG793252祁木香的序列與北沙參基本不同。

2.4 北沙參及其混偽品的種內種間遺傳距離分析

基于K2P模型計算北沙參與其混偽品的K2P距離，北沙參種內K2P遺傳距離平均為0.002，種內最大K2P遺傳距離為0.004。北沙參與其混偽品的種間遺傳距離最小為0.028，遠遠大于北沙參的種內最大遺傳距離，表明ITS2能夠準確區分北沙參及其混偽品（表2）。

2.5 北沙參及其混偽品的聚類分析

基于得到的12條ITS2序列，然后從GenBank下載13條序列，利用鄰接法（NJ法）構建系統聚類樹?？梢钥闯?，MG793241～MG793243、MG793245、MG793248～MG793250共7條序列與GenBank下載的北沙參的序列（KF010586～KF010588）聚為1支。MG793246和MG793247因為與北沙參的種間變異較多而單獨聚為1支，MG793244也因為與北沙參的種間變異較多而單獨聚為1支，這3個樣品的外形與北沙參無異，但因為種間變異數較多，是否會影響到藥效，須要作更深一步研究。從GenBank下載的KM191311～KM191315均為輪葉沙參，因此聚為1支，KM191316～KM191320均為沙參，因此聚為1支。祁木香MG793252與川明參聚為1支，說明祁木香與川明參有相似之處（圖3）。

2.6 北沙參及其混偽品的二級結構比較

利用locARNA方式對北沙參及其混偽品的ITS2進行二級結構預測，圖4表明，北沙參與川明參和輪葉沙參的二級結構存在較大差異，能夠很明顯的區分。祁木香的主環結構與北沙參相似，但其莖環結構與北沙參相差較大，區別也較明顯（圖4）。由此可以看出，利用二級結構也能夠很好地區別北沙參及其混偽品。

3 討論與結論

我國中藥材資源豐富，種類繁多，但是在藥材流通市場上仍然有摻雜使假現象發生?！吨袊幍洹罚?015版）中對北沙參的鑒別方法有物理和化學2種方法，但是這2種方法已經不能滿足市場對藥材鑒別方法的需要[12]。DNA條形碼技術的發展為中藥材的鑒定提供了全新的技術手段，已經被《中國藥典》中部分中藥列為藥材鑒定的方法之一。本研究說明了利用DNA條形碼技術鑒定北沙參藥材的可行性。

在利用DNA條形碼技術鑒定北沙參藥材的過程中，選擇了不同產地的北沙參，結果發現河北安國產的北沙參中有種內變異的情況。將發生種內變異的MG793244、MG793246、MG793247 3個樣品重新提取DNA，PCR后送測序，結果與先前相同，說明確實發生了種內變異，但該變異屬于無害的變異，并未影響到北沙參的性狀。

由于對干燥堅硬的北沙參藥材進行DNA提取，因此在提取過程中進行了多種方法的試驗[13]，通過鋼珠振動將北沙參藥材研磨得盡量細碎，同時通過延長DNA提取時間使干燥細胞充分裂解，從而提高所得DNA的濃度，保證后續PCR的效果。本試驗中的12份樣品均可擴增出單一明亮條帶，基于K2P距離建立的NJ樹以及二級結構的預測都能夠很好地將北沙參及其偽品區分開來。12份市場藥材中正品10份，偽品1份，祁木香為陰性對照，正品率為83.3%。雖然在12份樣品中只有1份川明參，但是因為川明參和北沙參的功效是不同的， 因此，如果誤將川明參作北沙參入藥，仍會給臨床用

藥帶來隱患。因此，中藥材市場仍須凈化以保證臨床用藥安全。

綜上所述，DNA條形碼技術能夠準確地鑒別北沙參及其偽品，本試驗所鑒定的12份樣品的結果與藥材鑒定專家的鑒定結果一致，說明DNA條形碼技術是安全、高效的藥材鑒定技術，在中藥材流通及市場監管中有很大的應用推廣價值。

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