角膜堿燒傷中PMNs與MMP-9的關系

宋東宇，高明宏，李冬梅

0引言

角膜堿燒傷是臨床上常見的嚴重致盲性眼外傷，由于堿易于浸潤至深層角膜，造成角膜病灶組織的潰瘍溶解，燒傷早期即有復雜的炎癥反應，多形核中性白細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)為病灶內重要的炎性細胞。PMNs浸潤角膜基質層并不斷吞噬壞死組織，直至引起PMNs細胞溶酶體破裂，產生大量蛋白酶加重基質層的潰瘍溶解[1]。角膜基質層中含有大量的膠原成分，在堿燒傷潰瘍損傷過程中有大量細胞因子、酶類參與，其中基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在損傷中發揮了關鍵作用，MMP-9又稱明膠酶B，活化后能分解多種膠原成分，易造成角膜基質層嚴重的潰瘍溶解[2]。堿燒傷后的病理損傷機制非常復雜，角膜病灶區嚴重的炎癥反應和基質層潰瘍溶解并存，兩者是否具有一致性，如何認識PMNs與MMP-9的相互作用及其關系，尚需深入研究。本文通過建立在體動物角膜堿燒傷模型，探究角膜堿燒傷后PMNs浸潤和MMP-9的表達時相，并且創新性的研究二者的相關性，為深入研究及治療角膜堿燒傷提供理論依據。

圖1裂隙燈下觀察角膜堿燒傷情況A：堿燒傷后3d,角膜基質層潰瘍水腫，病灶邊界不清；B：堿燒傷后14d,角膜基質層嚴重潰瘍溶解；C：堿燒傷后28d，角膜基質層潰瘍減輕，瘢痕形成。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選用健康清潔級新西蘭白兔25只(首都醫科大學動物研究中心提供)，10～12月齡，體質量2.0～3.0kg，雌雄均用，右眼為實驗眼，左眼為正常對照眼，實驗前仔細檢查眼部無病變。動物實驗過程中，嚴格遵循國家科技部頒布的《實驗動物管理條例》，同時本研究獲得朝陽市中心醫院倫理委員會的批準。

1.1.2實驗器材使用試劑：鼠抗兔MMP-9抗體(Abcam)；辣根酶標記山羊抗鼠IgG、SP及DAB試劑盒(Bioss);纖維濾紙(BOSTER)。使用儀器：超凈工作平臺(SW-CJ-IFD，沈陽)、勻速振蕩器(JHYC-3，蘇州)、水浴箱(ZD600，蘇州)、精密切片機(HM325，美國)、漂烘器(ZMN-6802，日本)、圖像分析儀(Image8000，北京)、裂隙燈(SL-6F，蘇州)、高倍顯微鏡(CK53，深圳)和圖像分析系統(Image Plus6.0，沈陽)。

1.2方法

1.2.1角膜堿燒傷模型的建立依據中華醫學會眼外傷學組制定的角膜燒傷標準，建立兔右眼角膜Ⅲ級堿燒傷的動物模型，操作由同一有經驗的實驗人員完成。為確保濾紙片大小形狀一致，用直徑為8.0mm的角膜移植環鉆鉆取多張圓形單層濾紙片，充分浸泡于1.0mol/L NaOH溶液中10s，鑷子夾取后置于器皿盒內備用。器械固定實驗兔頭部，右眼置開瞼器，20g/L鹽酸丙美卡因滴眼液點眼4次充分表面麻醉，把浸泡備用的濾紙片置于角膜中央區，確保濾紙與角膜表面充分接觸，計時1min后取下，注射器抽取大量生理鹽水沖洗上瞼穹窿部及角結膜表面5min，確保無NaOH溶液殘留(經反復預實驗，堿燒傷角膜1min,生理鹽水沖洗5min，能確保角膜達到Ⅲ級燒傷，且燒傷程度不至于角膜穿孔)。按此方法對25只兔右眼均進行角膜堿燒傷模型的建立[2]。

1.2.2模型治療及處理角膜堿燒傷后3d內，角膜損傷較重，為避免角膜穿孔和實驗動物的眼部不適，兔雙眼(實驗組和對照組)均給予非抗生素藥物，小牛血去蛋白提取物眼用凝膠，4次/d，點雙眼。分別于堿燒傷后3、7、14、21和28d從模型兔中隨機選取5只，按照0.2mL/100g體質量腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪1∶1混合液麻醉后，裂隙燈下觀察雙眼角膜并進行眼表照相，隨即靜脈注入空氣窒息法處死[2]。實驗動物發生嚴重眼內出血或角膜溶解穿孔則予剔除。

1.2.3角膜處理和數據獲取兔被麻醉處死后，沿角膜緣環形剪開球結膜及筋膜，快速剪斷眼外肌和視神經，摘除雙側眼球，完整切取帶有1.0mm寬鞏膜的角膜組織，10%甲醛溶液固定24～48h，常規不同濃度乙醇梯度脫水，應用二甲苯溶液致透明化，石蠟包埋，4μm連續切片[1]。

2結果

2.1裂隙燈下觀察堿燒傷后3d兔右眼球表面大量粘稠分泌物，燒傷病灶呈現邊界不清的灰白色潰瘍，深度達角膜基質層，窺視不清眼內結構(圖1A)。14d實驗組的角膜潰瘍深度及面積最為嚴重，病灶周邊大量新生血管生長，角膜病灶潰瘍溶解最重，達高峰期(圖1B)。28d實驗組角膜潰瘍區基本瘢痕化，表面新生血管生長，透明度極差(圖1C)。對照組角膜無明顯變化。

圖2HE染色切片觀察PMNs和新生血管(×400)A：堿燒傷后3d；B：堿燒傷后14d。三角示PMNs,箭頭示新生血管。B圖與A圖比較，可見堿燒傷后PMNs和新生血管增多,角膜基質纖維更為紊亂。

圖3MMP-9陽性表達(SABC×400)A：角膜堿燒傷后14d，大量MMP-9表達；B：角膜堿燒傷后28d，MMP-9表達趨于下降。

組別眼數MMP-9實驗組內相互比較q值(P值)7d14d21d28d正常對照組250.0015±0.0006堿燒傷3d50.2842±0.01304.1534(<0.05)10.1663 (<0.01)4.7294(<0.05)2.4355(>0.05)堿燒傷7d50.2431±0.015014.3197 (<0.01)8.8829(<0.01)1.7180(>0.05)堿燒傷14d50.3848±0.03405.4368(<0.01)12.6017(<0.01)堿燒傷21d50.3310±0.02707.1649(<0.01)堿燒傷28d50.2601±0.0130

2.2 HE染色切片觀察400倍生物顯微鏡下觀察HE染色切片，PMNs為鏡下視野內胞核藍色且深染的細胞。堿燒傷后3d，角膜潰瘍區上皮組織缺如，基質層水腫肥厚，膠原纖維部分紊亂，角膜上皮下及基質層可見少量PMNs；堿燒傷后14d，病灶區周邊殘存的上皮層細胞水腫，基質層溶解變薄，大量纖維溶解斷裂且排列紊亂，可見新生血管生長，特別是潰瘍溶解區的基質層細胞中存在大量PMNs浸潤，呈團簇樣存在且胞核較大(圖2)。

2.3 PMNs的量值兔角膜堿燒傷后3、7、14、21、28d角膜病灶組織中PMNs密度值分別為58.34±4.67、46.34±2.36、90.07±5.67、83.23±3.31和43.28±3.45個/1000μm2。正常對照組角膜基質內幾乎未見PMNs細胞。實驗組不同時間點PMNs密度值變化比較明顯，堿燒傷后3d角膜基質層即可見大量PMNs浸潤，7d時數量略有下降，繼而快速增多，即在14d時達到頂峰，之后逐漸減少，28d時下降至接近7d時數量。

2.4角膜堿燒傷后MMP-9的表達堿燒傷后的角膜基質層溶解高峰出現在14d，觀察免疫組化圖片可發現堿燒傷14d的角膜基質層中MMP-9的量值達到頂峰，隨后角膜堿燒傷后的28d，MMP-9的表達明顯減少，角膜溶解潰瘍的病損修復過程與MMP-9的表達緊密相關(圖3)。

經檢驗分析，實驗數據服從正態分布，滿足方差齊性，實驗組內各時間點MMP-9陽性細胞平均光密度值隨時間延長出現明顯波動(先上升后下降)，差異有統計學意義(F=33.78，P<0.01)。兔左眼為對照組(正常眼)，各時間點MMP-9陽性細胞平均光密度值平穩無變化，求取平均值作為對照組均值。不同時間點實驗組MMP-9陽性細胞平均光密度值均高于對照組，組間均數比較用Dunnett-t檢驗(表1)，3、7、14、21和28d差異明顯，均具有統計學意義(P<0.05)。實驗組內各時間點的MMP-9陽性細胞平均光密度值相互比較用SNK-q檢驗(表1)，可見不同時間點MMP-9陽性細胞平均光密度值變化明顯(P<0.05)，堿燒傷后3d即有大量MMP-9產生，7d時有所下降，之后明顯提升且在14d時達到高峰，14d后逐漸降低，在28d降至接近燒傷7d時水平。

2.5量值相關性角膜堿燒傷后病灶組織內PMNs的浸潤與MMP-9的表達的量值呈正態分布，對兩組數值進行Pearson相關性檢驗，呈正相關(r=0.963，P=0.004)。

3討論

角膜堿燒傷是臨床上較為多見的，治療較為困難的嚴重眼表疾病，早期即出現大量炎性細胞浸潤，隨著病程的進展常可見眼表持續性病損、角膜潰瘍溶解、角膜混濁瘢痕及大量新生血管等，尤其是角膜基質層損傷較重，細胞外基質(extracelluar matrix,ECM)主要包括膠原、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和彈力纖維五大類，其中膠原是ECM中最豐富的結構成分。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可作為降解細胞外基質的酶類，在角膜組織潰瘍溶解損傷及細胞遷移修復中發揮重要的作用[3]，而MMP-9作為MMPs家族中的重要一員，在角膜基質的病理損傷過程中能夠降解大量膠原[4-5]。MMP-9又被稱為明膠酶B，相對分子量為92kD，以無活性的酶原形式分泌，主要存在于角膜基質層中，活化后能降解Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、彈性蛋白和明膠。正常角膜中只能微量檢測到MMP-9表達，而在兔角膜堿燒傷后的病灶區內，MMP-9表達明顯增加，在我們的研究中，實驗組與對照組的量值做統計學分析，均有統計學意義，可以說明MMP-9在角膜堿燒傷后的潰瘍溶解中具有重要作用，并且與炎性反應明顯呈正相關。在本研究中發現，免疫定位MMP-9，其主要分布于潰瘍的角膜基質、浸潤的炎細胞和新生血管的內皮細胞中，這與Ma等[6]通過原位酶譜技術檢測的研究結果相一致，MMP-9能夠大量降解角膜基質，從而引起嚴重的損傷。

研究發現堿燒傷后3d角膜上皮層及基質層病灶中就存在大量的PMNs浸潤，第7d量值卻有下降，堿燒傷后的14d則達到浸潤的峰值，大量角膜基質潰瘍溶解，甚至是穿孔，傷后14d為角膜組織病理損傷的嚴重期，炎癥反應也最為嚴重，PMNs浸潤達到最大值，角膜堿燒傷后的潰瘍溶解與PMNs的浸潤水平顯著相關，這與報道文獻[2,7]的研究一致。因正常對照組的角膜基質層未見明顯的PMNs存在，實驗組與對照組差異明顯，我們未進行組間的統計學分析。在空間分布上，早期PMNs分布在堿燒傷創口邊緣的角膜基質內，主要有外源性堿性物質致傷所引起，角膜表面無浸潤；后期PMNs浸潤部位與潰瘍部位一致，主要是與免疫性炎癥反應相關，這與Peebo等[8]的研究結果相同。堿燒傷后PMNs浸潤損傷角膜組織的病程進展快速，進入角膜基質的PMNs大量吞噬壞死物質，進而使溶酶體破裂，溶酶體酶大量進入角膜燒傷潰瘍區，對膠原進行溶解破壞，有研究證實明膠酶MMP-9與中性白細胞相關[9-11]。Noerager等[12]通過對外周血中的PMNs細胞分離提取后，在PMNs碎裂物及上清液中分離到MMP-9的存在。而我們的研究是通過制做角膜堿燒傷的動物模型，在活體動物的角膜炎性病灶組織中測得PMNs及MMP-9的量值，所得實驗數據更準確、直觀，并對堿燒傷不同時相的PMNs與MMP-9量值做Pearson相關性檢驗，相關系數r=0.963，P=0.004，從而創新性地證明了二者關系密切，且具有明顯正相關性。實驗方式不同，無論是通過外周血的細胞提取，還是通過直接的活體動物實驗，其結果具有一致性，但我們的實驗數據直接在角膜炎癥病灶內測得，更能表達和證實二者的相關性，且通過統計學分析證實相關性明顯具有統計學意義(P<0.01)。

按照McCulley的研究，化學性角膜燒傷可以分為以下四期：角膜燒傷期(燒傷當時)、損傷急性期(0～7d)，角膜修復早期(1～3wk)和角膜修復晚期(大于3wk)[2,13]，我們通過建立動物模型，研究堿燒傷急性期、修復早期和修復晚期的角膜潰瘍區的組織病理損傷及病程進展中PMNs浸潤和MMP-9表達的時相，依據統計學分析充分證實二者具有明顯正相關性，該理論能夠為臨床治療角膜堿燒傷提供新思路。臨床上治療早期角膜堿燒傷，控制炎癥即是抑制PMNs的浸潤和減少MMP-9的大量表達，依據二者的正相關性，抑制炎性反應，促進上皮的早期修復，可以減少角膜病灶的潰瘍溶解，進而有效地減輕角膜病灶的病理性損傷。

依據本研究中PMNs及MMP-9的變化曲線，在角膜堿燒傷后3d內就要頻點抗炎眼液，早期應用小牛血去蛋白提取物眼用凝膠類藥物，稀釋殘存堿性物質，促進上皮層的修復，減少炎性細胞浸潤，而7～21d是燒傷后的角膜潰瘍溶解期，在抗炎治療的同時要抑制基質蛋白酶類的溶解作用。堿燒傷14d后，即可應用促進上皮和基質修復的眼膏或眼液，進而達到促進修復減少瘢痕的最佳療效[2,13]。在臨床診治上，炎癥反應和MMPs的潰瘍降解密切相關，角膜堿燒傷的病理損傷是多因素共同作用的結果，炎癥反應與新生血管生長因子的相互關系，MMPs家族中其他的酶類因子是否與炎性反應相關，尚需實驗研究。