抗生素與三唑類殺菌劑混合物對羊角月牙藻的長期毒性相互作用研究

農瓊媛，覃禮堂,2,3,*，莫凌云,2,3，劉勇安，梁延鵬,2,3

1. 桂林理工大學 環境科學與工程學院，桂林 541004 2. 桂林理工大學 廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，桂林 541004 3. 桂林理工大學 巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，桂林 541004

抗生素是人類醫學史上最偉大的發現之一，它被廣泛用于人類和動物感染性疾病的治療。例如，在養殖業中，抗生素作為畜禽預防及治療疾病的主要藥物被大量使用[1]。有報道指出，約有10%～90%的獸用抗生素以原藥或代謝產物的形式隨糞便排放到水環境中[2]。加上我國是抗生素生產和使用大國，且濫用現象日益嚴重[3]，在河水、海水、地下水，甚至飲用水都檢測到了抗生素的存在[4]。雖然在水環境中檢出濃度通常較低，在ng·L-1～μg·L-1的濃度水平[5]，但是由于抗生素頻繁使用并進入水環境中，使得抗生素在水體中持續存在，即表現出“假持續”現象，從而對整個水生生態造成長期的潛在危害，最終對人類健康造成潛在威脅[6]。四環素類和氟喹諾酮類抗生素是目前我國地表水體中檢出率較高的2類抗生素，特別是土霉素(四環素類)和環丙沙星(氟喹諾酮類)的檢出濃度較高[7-8]，它們的檢出濃度水平為1～2 796.6 ng·L-1[9-10]。

農藥是現代農業生產不可或缺的物質。大量研究表明，農藥殘留可能通過食物鏈傳播，最終對人類健康構成威脅[11]。三唑類殺菌劑因具有抗菌作用及調節植物生長作用[12]，成為公認的最有效和最有前途的殺菌劑之一[13]，特別是戊唑醇，其殺菌譜較廣，可用于對擔子菌、子囊菌及半知菌三大亞門真菌引起的多種病害的防治，已經廣泛應用于防治蔬菜、水果及花卉的病蟲害[14]，它大量使用不可避免地隨降雨和地表徑流進入水體環境中，在地表水中檢測到的濃度高達175～200 μg·L-1[15]，對水生生物及人體健康產生潛在危害[16]。研究表明，戊唑醇可能是環境內分泌干擾物[17]，在環境中殘留有可能會對人類的類固醇生物合成產生一定的影響。此外，三唑類殺菌劑中的戊唑醇已經被美國環保局列入可能的人類致癌物名單[18]。

在實際環境中，水生生態系統通常暴露于多種外源化合物，抗生素和農藥作為水生生物和人類頻繁接觸的外源化合物，可能會同時暴露[19]，且最新研究發現，抗生素的使用會提高農藥的生物利用率，進而增大農藥暴露的危害風險[20]。Xu等[21]報道在中國7個主要流域共檢測出103種藥物及個人護理品(PPCPs)和19種農藥，其中包括環丙沙星、土霉素和戊唑醇3種污染物。因此，研究抗生素和農藥共暴露的毒性作用具有重要現實意義。綠藻作為水生生態系統中重要的初級生產者，是反映水體環境質量的重要指標。羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)具有個體小、繁殖快和易獲得等特點，且對有毒物質敏感度高[22]，已被生態環境部列為化學品風險評價的標準測試生物之一。然而，目前大多數研究者停留在對單一標準的96 h綠藻急性微板毒性測試，標準的綠藻急性毒性實驗因其作用時間短，僅僅適用于快速表現出毒性的化合物的測定，對于測定影響生物生長繁殖過程的化合物的毒性，實驗歷經時間必須超過綠藻的世代時間[23]。單純依據標準急性毒性實驗方法獲得的結果可能會嚴重低估或高估污染物的毒性[24]，因而延長其暴露時間能更真實地反映真實情況。由于抗生素具有絡合性，在環境介質中會與農藥、重金屬等其他污染物共存形成復合污染物，而現有報道則多為單種或多種抗生素的試驗研究[25]，涉及抗生素與農藥的聯合效應的研究較少，尤其關于抗生素與農藥在環境水體中同時暴露對綠藻產生的聯合毒性作用隨暴露時間延長的變化卻鮮有報道。

本文擬以2種抗生素包括四環素類的土霉素(OXY)和氟喹諾酮類的環丙沙星(CIP)及1種三唑類殺菌劑農藥戊唑醇(TCZ)為研究對象，以羊角月牙藻為指示生物，采用直接均分射線法(EquRay)[26]設計3組二元混合體系，包括1組抗生素-抗生素(OXY-CIP)、2組抗生素-三唑類殺菌劑(OXY-TCZ、CIP-TCZ)。每組混合體系有5條射線，共15條混合物射線。應用濃度加和(CA)與獨立作用(IA)[27]模型分析混合物長期暴露的毒性相互作用，揭示抗生素與農藥在水體環境中同時暴露對綠藻產生的聯合毒性作用隨暴露時間延長的變化規律，為全面準確評價抗生素與農藥在環境中的潛在風險提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 目標化合物

研究選取使用量較大且具有代表性的2種抗生素與1種三唑類殺菌劑。其中，土霉素與環丙沙星2種抗生素分別屬于四環素類與氟喹諾酮類，戊唑醇屬于三唑類殺菌劑，其理化性質詳見表1。用對綠藻毒性小的體積濃度不超過5‰的二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑溶解，儲備液用Mill-Q水配制，并置于4 ℃冰箱中保存、備用。

1.2 受試生物及藻種培養

受試生物羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)購自中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，其編號為[FACHB-271]。選用BG11培養基[28]培養羊角月牙藻。在無菌潔凈工作臺中將實驗用藻接種到裝有新鮮培養基的250 mL錐形瓶內，然后放入人工氣候恒溫光照培養箱進行培養，設定溫度22 ℃，光照強度約2 500～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h。每隔2～3 d按1∶1稀釋轉接藻種，在藻類細胞代謝最旺盛時期接種(上午10～11時左右)，反復接種2～3次，待藻類基本達到同步生長階段，并處于對數生長期時，作為實驗用藻。每次接種時先在顯微鏡下觀察藻種生長情況，其生長曲線繪于圖1。

圖1 羊角月牙藻生長曲線注：圖中( )為3個平行實驗組。Fig. 1 Growth curve of Selenastrum capricornutumNote: In the figure ( ) are three parallel experimental groups.

1.3 混合物設計

為系統研究抗生素與三唑類殺菌劑混合物在長期暴露下產生毒性大小的變化規律，采用直接均分射線法(EquRay)[26]設計抗生素與三唑類殺菌劑二元混合體系，每個混合物體系共有5條射線，分別標記為R1、R2、R3、R4和R5。

1.4 綠藻毒性測試

用血球計數板測定處于對數生長期的試驗綠藻的藻細胞密度，用培養基將藻液稀釋，使綠藻的初始密度約為106cell·mL-1。

毒性測試以透明的96孔微孔板[29]作為測試載體，在微板四周共36個孔各加入300 μL水，防止產生邊緣效應。余下60個孔的第2、6、7及11列共24個孔中是空白對照組，空白對照組加入與實驗組相同含量的DMSO。第3列共6個孔以及第8列共6個孔分別加入按0.618的稀釋因子設計的12個不同濃度的毒物100 μL，第4和5列為第3列的平行實驗，第9和10列為第8列的平行實驗，然后在除四周外的60個孔中均加入100 μL已稀釋好的綠藻溶液，使各孔的試液總體積為200 μL，每個濃度至少重復3塊板，蓋上透明蓋板密封，靜置15 min，將板置于TECAN帝肯Infinite M200 Pro多功能酶標儀中測定光密度值(OD)，作為暴露時間t=0 h，然后將測完后的板置于光照培養箱中培養，將培養箱設定溫度為22 ℃，光照度約2 500～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h；每天定時將微板交叉調換位置4次，使之均勻接受光照，分別在96、120、144和168 h測定其OD值，并由此計算對應時間點的目標污染物對羊角月牙藻的生長抑制率。

表1 目標化合物的基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of the test compounds

1.5 毒性數據處理與擬合

采用兩參數非線性函數Weibull(式(1))和Logit(式(2))對濃度-效應數據進行非線性最小二乘擬合，選擇確定系數(R2)最大或均方根誤差(RMSE)最小者為最優擬合函數[30]。

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(1)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(2)

式中：α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數，E為效應即污染物對綠藻的生長抑制率，c是污染物的濃度。

1.6 混合物毒性相互作用分析

為了更加客觀準確地分析混合物毒性相互作用，同時采用了參考模型CA(式(3))和IA(式(4))定性評估混合毒性[27]。觀測毒性大于參考模型預測毒性稱為協同作用，小于預測毒性則稱為拮抗作用，若等于預測毒性則稱為無相互作用或加和效應。

(3)

(4)

式(3)中：ECx,mix是混合物產生x%效應時對應的效應濃度；ECx,i為第i個組分單獨存在時產生x%效應時對應的效應濃度；pi是第i個組分的摩爾濃度比。式(4)中，x%為混合物效應，fi是第i個組分的濃度-效應曲線(CRC)最佳擬合函數；Pi是混合物第i個組分的摩爾濃度比。

1.7 評估混合物相互作用

為了定量評估混合物的相互作用，基于CA與IA模型[27]，利用模型偏差比(MDR)[31]評估混合物相互作用，參見式(5)。

(5)

式(5)中：ECx,pred為某指定效應下參考模型CA或IA預測的效應濃度，ECx,obs為實驗濃度。

2 結果(Results)

2.1 單一污染物對羊角月牙藻的毒性

3種目標污染物在不同時間節點的濃度-效應數據以及通過非線性函數擬合的結果列于表2中，其濃度-效應(CRC)繪于圖2中。

圖2 3種目標污染物對羊角月牙藻96 h與168 h的濃度-效應關系注：圖中黑色散點()及空心散點()為實驗點；黑色虛線()為95%的置信區間；藍色實線()及紅色實線()為擬合線。Fig. 2 Concentration-effect relationship of three target pollutants on Selenastrum capricornutume at 96 h and 168 hNote: The black scatter () and the hollow scatter () are experimental points; the black dotted line () is a 95% confidence interval; the solid blue line () and the solid red line () are fitted lines.

從表2可看出，Logit或Weibull函數能較好地擬合土霉素、環丙沙星和戊唑醇對羊角月牙藻在96～168 h的濃度-效應數據，R2均大于0.97，RMSE均小于0.03。同一污染物的半數效應濃度(EC50)在96～168 h隨暴露時間的延長逐漸減小，pEC50逐漸增大，毒性大小順序為168 h > 144 h > 120 h > 96 h。根據pEC50數值可知，在同一暴露時間點，不同污染物毒性大小順序為OXY > TCZ > CIP。雖然污染物隨暴露時間的延長，pEC50變化不明顯，但是由于抗生素與農藥難以遏制的濫用狀況，大量持續排入環境中，時間依賴毒性不容忽視。

從圖2可看出，3種目標污染物對羊角月牙藻的抑制率均是168 h>96 h。不同污染物的劑量效應變化關系不同，且毒性增加的程度不同，這表明3種污染物均具有一定的時間依賴毒性，即隨著暴露時間的延長，污染物對羊角月牙藻的毒性逐漸增強。總之，168 h的毒性略大于96 h的毒性(圖2和表2)。

2.2 二元混合物對羊角月牙藻的毒性相互作用

在OXY-CIP混合體系中，同一濃度比(Pi)在不同暴露時間點的CRC、CA和IA預測結果繪于圖3。從圖中可知，混合物的高濃度區域CA和IA預測結果均在95%置信區間上限的上方，即為拮抗作用；低濃度區域CA和IA預測結果位于95%置信區間上限和下限之間，表明混合物為加和作用；中濃度區域隨著暴露時間的延長，由加和作用逐漸變成協同作用，且協同作用大小逐漸增大，在10%效應下的MDRCA與MDRIA分別增加了0.51和0.77。

在OXY-TCZ混合體系中，同一濃度比(Pi)在不同暴露時間點的CRC及CA和IA預測結果繪于圖4。由圖可知，暴露時間為96～168 h的高濃度區域均呈拮抗作用，低濃度區域由協同作用(96～120 h)變成加和作用(144～168 h)。在96～120 h，協同作用大小隨暴露時間的延長逐漸增大，在10%效應下的MDRCA與MDRIA分別增加了1.00和1.46。

在CIP-TCZ混合體系中，同一濃度比(Pi)在不同暴露時間點的CRC及CA和IA的預測結果繪于圖5。由圖5可以看出，96～168 h中CA和IA的預測結果為：高濃度區域均呈拮抗作用；低濃度區域均在95%置信區間下限的下方，即為協同作用，且隨暴露時間的延長，協同作用大小逐漸變大；在10%效應下的MDRCA與MDRIA分別增加了2.22和2.68。

表2 3種目標污染物對羊角月牙藻不同時間節點的濃度-效應擬合參數Table 2 Fitting parameters of concentration-effect of three target pollutants on Selenastrum capricornutum at different time points

注：α和β是Logit和Weibull函數的擬合參數；R2和RMSE分別是確定系數和均方根誤差；EC50為半數效應濃度；pEC50為EC50的負對數。

Note:αandβare the fitting parameters of the Weibull or Logit function; R2and RMSE are the coefficient of determination and the root mean square error, respectively; EC50is the median effect concentration; pEC50is -logEC50.

圖3 OXY-CIP混合體系對羊角月牙藻毒性的濃度-效應曲線(CRC)及濃度加和(CA)和獨立作用(IA)預測結果注：圖中黑色散點()為實驗點；()為相互作用分界線；黑色虛線()為95%的置信區間；ANT表示拮抗作用，ADD表示加和作用，SYN表示協同作用；下同。Fig. 3 The concentration-response curves (CRCs), concentration addition (CA) and independent action (IA) predictions of mixture toxicity of OXY-CIP to Selenastrum capricornutumNote: The black scatter () is the experimental point; () represents the interaction boundary; the black dotted line () is the 95% confidence interval; ANT represents antagonism; ADD represents additive; and SYN represents synergy; the same below.

圖4 OXY-TCZ混合體系對羊角月牙藻的CRC及CA和IA預測結果Fig. 4 The CRCs, CA and IA predictions of mixture toxicity of OXY-TCZ to Selenastrum capricornutum

圖5 CIP-TCZ混合體系對羊角月牙藻的CRC及CA和IA預測結果Fig. 5 The CRCs, CA and IA predictions of mixture toxicity of CIP-TCZ to Selenastrum capricornutum

由以上結果可知，3組二元混合體系的毒性變化規律與單一化合物的毒性變化規律一致，168 h的毒性總是大于96 h的毒性，且隨著暴露時間的延長毒性增加的程度不同。這表明抗生素與農藥的聯合毒性均具有一定的時間依賴毒性，即隨著暴露時間的延長，其毒性逐漸增強，但不同抗生素與農藥聯合作用隨暴露時間的延長變化規律不同。3組二元混合體系在不同暴露時間點對羊角月牙藻產生拮抗作用均出現在高濃度區域。在OXY-CIP混合體系中，低濃度區域均呈加和作用；中濃度區域隨著暴露時間的延長(96～168 h)，由加和作用逐漸變成協同作用，且協同作用大小逐漸增大，在10%效應下的MDRCA與MDRIA分別增加了0.51和0.77；在OXY-TCZ混合體系中，低濃度區域由協同作用(96～120 h)變成加和作用(144～168 h)；在CIP-TCZ混合體系中，低濃度區域呈協同作用，隨暴露時間的延長(96～168 h)，協同作用大小逐漸變大，在10%效應下的MDRCA與MDRIA分別增加了2.22和2.68。因此，毒性相互作用類型與濃度范圍、混合物組分和暴露時間三者密切相關。

3 討論(Discussion)

抗生素長期暴露會引起抗藥菌群的出現而威脅公眾健康，成為近年來環境健康領域的研究熱點之一。越來越多的研究表明，部分污染物單純依據標準急性毒性實驗方法獲得的結果可能會嚴重低估或高估污染物的毒性[24]，因而延長其暴露時間，使其檢測結果能更真實地反映實際情況。而不同的污染物具有不同的時間毒性變化規律[28]。本研究發現，單一污染物168 h的毒性總是大于96 h的毒性，且隨著暴露時間的延長每種污染物毒性增加程度不同；同時還發現不同混合體系隨暴露時間的變化呈現的毒性相互作用類型不相同。如OXY-TCZ混合體系在120～144 h中，低濃度區域由協同作用變為加和作用；在CIP-TCZ混合體系中，低濃度區域呈協同作用的大小隨著暴露時間(96～168 h)的延長，協同作用大小逐漸增大。因此混合物暴露時間是相互作用的主要影響因素之一。

不同的二元混合體系(抗生素-抗生素、抗生素-農藥)呈現不同的作用類型，包括拮抗作用、協同作用和加和作用。Syberg等[32]指出，化學物質的作用模式可能隨著濃度的改變而變化，即同一混合物在不同濃度區域呈現的毒性作用類型不相同。本研究也發現，對于OXY-CIP二元混合體系對羊角月牙藻的毒性相互作用，相同混合物射線(相同濃度比例)在不同濃度范圍呈現不同的毒性作用類型，如OXY-CIP在高濃度區域呈拮抗作用，而中濃度區域呈協同作用，低濃度區域呈加和作用。相同的暴露時間不同混合物組分相互作用類型呈現不同的結果，莫凌云等[33]也報道不同混合物體系在同一暴露時間呈現不同相互作用結果。如在相同暴露時間144 h時，OXY-TCZ在高濃度區域呈拮抗作用，低濃度區域呈加和作用，而CIP-TCZ在高濃度區域呈拮抗作用，低濃度區域呈協同作用。因此，混合物相互作用類型與濃度范圍、混合物組分有關。

抗生素與農藥之間的毒性相互作用機理比較復雜，OXY-CIP、OXY-TCZ和CIP-TCZ混合體系在較高濃度區域均呈拮抗作用，在高濃度區域混合物表現出拮抗作用意味著該組混合物中，起決定作用的組分在對羊角月牙藻致毒過程中出現了不同的毒性效應或者類似競爭作用位點的可結合性降低，即“競爭性拮抗作用”[34]，從而減弱了對方的毒性。在混合體系CIP-TCZ中，低濃度區域出現協同作用的原因，可能是由于抗生素與農藥(CIP-TCZ)共同存在時，綠藻的細胞膜通透性增強，污染物更容易進入細胞內，并與酶發生反應，導致吸光減弱，從而對綠藻的毒性增強[35]。藻類對不同抗生素與農藥的毒性具有一定的適應性，即表現為對抗生素、農藥毒性的耐受能力。然而迄今為止，有關抗生素與農藥對藻類影響的研究大多局限于其單一物質對藻類急性毒性及健康風險等方面。自然水體中通常會有多種抗生素與農藥共存[36]，目前有關抗生素與農藥對藻類長期聯合毒性研究缺乏。本文結果中混合物的協同效應的濃度水平為10～1 000 μg·L-1，而實際環境中抗生素檢出濃度約為1～2 796.6 ng·L-1[9-10]，本實驗所研究的濃度范圍高于實際環境檢出濃度，加上對于抗生素與其他農藥之間的協同作用的機理解釋尚未統一。因此，未來需要關注環境濃度下的抗生素與其他污染物對藻類的聯合毒性效應，并從分子水平上揭示其毒性機制，這將會對地表水體中抗生素的生態風險評價提供重要的參考價值。