MDCK細胞懸浮馴化及對H9亞型禽流感病毒敏感性的研究

習 碩，趙 蕾，史愛華，章振華，李 林，沈 佳，崔麗娜，姜北宇，張建偉

(北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097)

禽流感 (Avian influenza, AI) 是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的禽流行性感冒。自1878年首先在意大利發現以來，全世界范圍內都有禽流感毒株引起的流感的流行，不僅給養禽業造成巨大的經濟損失，還給人類的公共衛生帶來嚴重威脅[1]。接種由流行毒株制備的疫苗，是預防禽流感最有效的手段。目前，國內的禽流感病毒疫苗抗原主要采用雞胚增殖的方法制備，然而使用雞胚制苗存在以下缺點：首先，病毒在雞胚中的連續傳代易造成HA基因發生變異[2-3]，從而導致病毒的免疫原性和病毒毒力的變化；其次，收獲的尿囊液中存在的雞胚雜質可造成被免疫雞的過敏反應；第三，大規模生產時雞胚來源不同，致使抗原批間一致性差；最后，收獲毒液后殘留的帶毒雞胚，處理不當也會造成潛在生物安全危害，為此急需尋求一種新的模式制備禽流感疫苗抗原[4]。

利用傳代細胞制備疫苗抗原為解決以上問題提供了思路，該方法制備的抗原具有穩定、重復性高、變態反應少等優點，在流感疫苗抗原制備領域，很多學者對MDCK細胞制備禽流感疫苗抗原進行了研究，MDCK細胞是由Madin 和 Darby采用健康雄性英國小獵犬(cocker spaniel)的腎臟建立的細胞系[5]，由于該細胞系對各種禽流感病毒均較敏感，已廣泛應用于禽流感病毒的檢測及培養領域，同時認為MDCK細胞最適合用于增殖禽流感病毒[6-7]。但多數研究以貼壁培養為主，本研究擬對MDCK貼壁細胞進行純懸浮馴化，以簡化將來用于大規模生物反應器培養時的培養工藝。

采用MDCK純懸浮細胞連續傳代培養增殖禽流感病毒制備禽流感疫苗抗原與采用雞胚制備疫苗抗原相比，不僅疫苗抗原的純度更高，而且還可以降低處理雞胚廢棄物的成本，減少生物安全危害，不僅有重要的實用價值還有社會意義。本試驗進行了MDCK貼壁細胞的懸浮馴化研究，以之作為基質制備禽流感病毒疫苗抗原，為采用更安全、高效、質量可控的細胞培養方式生產禽流感疫苗抗原工藝奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞株和病毒株 貼壁MDCK細胞株購自中國獸醫藥品監察所，傳代至F71；H9亞型禽流感病毒BX13株由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所免疫預防研究室2013年從北京某雞場分離、純化及鑒定，毒株代號為A/Chicken/Beijing/BX/13(H9N2)株(BX13)，HA效價為29，毒價為107.7EID50/0.1mL。

1.1.2 雞胚 10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養液購自HyClone公司；無血清培養基MS01購自蘇州市沃美生物技術有限公司；胎牛血清(FBS)購自PAN公司；臺盼藍染液購自Sigma公司；TPCK-Trypsin購自Gibco公司；1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備；T25、T175、T225細胞培養瓶購自Corning公司；250 mL三角瓶購自Corning公司。

1.1.4 儀器設備 細胞搖床購自上海一恒科技有限公司；倒置顯微鏡購自上海光學儀器廠；血球計數板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司。

2 方 法

2.1 MDCK貼壁細胞無血清培養基適應馴化 MDCK貼壁細胞用含10% FBS高糖DMEM培養基37 ℃ 5% CO2靜置培養至細胞狀態良好。待細胞生長至90%，棄去培養液，加入含有5% FBS 的培養液，培養細胞直至細胞長滿；逐漸減少培養基中FBS含量，直至細胞完全適應含1% FBS的DMEM，用無血清培養基MS01替代含有血清的DMEM。

2.2 MDCK貼壁細胞的懸浮馴化 將適應了無血清培養基的MDCK細胞消化轉移至250 mL三角瓶，細胞初始接種密度為5×105/mL，培養體積為50 mL，將三角瓶置于搖床上，轉速為100 r/min，37 ℃ 5% CO2培養。每48 h取出馴化的細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀細胞用新鮮培養基重懸，繼續培養直至細胞比生長速率穩定，進行分瓶傳代，使細胞進一步適應，直至MDCK細胞完全失去貼壁的能力，以懸浮方式穩定增殖，懸浮細胞命名為MDCK-sus。

2.3 細胞計數及形態觀察 以臺盼藍染色法，用血球計數板計活、死細胞數，繪制細胞生長曲線。

2.4 禽流感病毒在MDCK懸浮細胞中的增殖 取生長良好的MDCK-sus細胞分別稀釋成密度為5×105/mL、1.0×106/mL、1.5×106/mL、2.0×106/mL，置于三角瓶中，每瓶的培養體積為50 mL，以感染復數(MOI)=0.01接種H9亞型禽流感病毒BX13株，同時加入TPCK-Trypsin使其終濃度為3.5 μg/mL，接種完畢后將三角培養瓶放置在細胞搖床上，轉速為100 r/min, 35 ℃ 5% CO2進行振蕩培養；每24 h取樣測定培養液上清的HA價。

2.5 病毒HA效價的測定 測定方法為在96孔血凝板中每孔加入50 μL生理鹽水，第1孔加入50 μL待檢細胞培養上清，充分混勻后取50 μL加入第2孔，依次進行倍比稀釋至第10孔，并設陽性、陰性和空白對照孔，稀釋完畢后每孔中加入50 μL 1%雞紅細胞懸液，振蕩混合，室溫靜置20～30 min，觀察記錄結果，測定結果取以log2為底的倍數表示。

2.6 病毒EID50的測定 接毒后72 h，收獲培養的4個細胞密度制備的病毒液，放入-20 ℃冰箱凍融2次，取2.0×106/mL細胞密度制備的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-94個稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置于37 ℃孵育120 h，每24 h照蛋一次，棄去24 h內死亡雞胚，逐個收獲48～120 h雞胚液，分別測定HA效價，HA效價不低于1∶16判為感染，按照Reed-Muench法計算EID50。

3 結果與分析

3.1 MDCK貼壁細胞無血清培養基適應馴化 復蘇MDCK貼壁細胞，用含10% FBS的DMEM培養基培養，逐漸降低血清含量至1%，低血清馴化初期，MDCK細胞生長環境從含10% FBS的DMEM過渡到5% FBS的DMEM時，細胞未表現明顯的不適應，細胞生長速度未放緩，細胞形態未出現肉眼可見的變化；當馴化適應至1% FBS條件時，MDCK細胞生長速度比10% FBS組稍慢，細胞伸展拉伸，經過一段時間的馴化，細胞已適應1%血清生長環境，生長速度逐漸恢復，生長狀態良好，但細胞形態出現變圓趨勢，貼壁較松散，少量細胞甚至懸浮于培養基呈現懸浮生長狀態。用無血清培養基MS01替換含1%血清的DMEM培養基。

3.2 MDCK貼壁細胞的懸浮馴化 細胞無血清全懸浮馴化初期，細胞生長速率較低，經過一段時間的傳代，細胞適應。以5×105/mL的密度轉移細胞至250 mL三角瓶，培養體積為50 mL, 轉速為100 r/min, 每24 h觀察細胞生長狀態，在MS01無血清培養基懸浮馴化后期，MDCK細胞邊緣清晰，表現完整的單細胞懸浮生長狀態，細胞大小較均一，結團現象較少，經過48 h的培養，細胞密度達到2.5×106/mL。倍增時間為24 h，細胞活率達到99%以上，說明MDCK細胞已經完全適應了無血清全懸浮生長環境。

3.3 細胞計數及形態觀察 MDCK貼壁細胞經培養馴化，細胞狀態如圖1，MDCK懸浮細胞生長曲線及對應細胞密度如圖2和表1。

A: 正常MDCK貼壁細胞；B: 適應低血清生長環境的MDCK細胞；C:無血清馴化后MDCK細胞懸浮培養形態A: Normal MDCK adherent cells;B: Adapted to low serum environment MDCK cells;C: All suspension MDCK cells圖1 MDCK細胞懸浮培養Fig 1 Suspension culture of MDCK cells

圖2 MDCK懸浮細胞生長曲線Fig 2 The growth curve of MDCK suspension cell

培養時間/h024487296120細胞密度/(105·mL-1)51225446190

3.4 禽流感病毒在MDCK懸浮細胞中的增殖 以不同密度的MDCK懸浮細胞進行H9亞型禽流感病毒BX13株的培養，添加3.5 μg/mL的TPCK-Trypsin，感染復數(MOI)為0.01，每24 h取樣觀察細胞病變，結果顯示接毒后24 h和48 h的細胞活率分別為98%和94%，72 h的細胞病變率為100%。

3.5 病毒HA效價的測定 每24 h取樣測定培養液HA滴度，結果見表2。

3.6 病毒EID50的測定 將H9亞型禽流感病毒BX13株以適宜的MOI和TPCK胰蛋白酶濃度接種密度為2.0×106/mL的細胞，收獲培養72 h接種制備的病毒液，測定培養液病毒含量為108.5EID50/0.1 mL(表3)。

4 討論與結論

我國獸醫生物制品行業多采用雞胚接種收獲尿囊液的方式制備禽流感疫苗抗原，但雞胚接種制備疫苗抗原存在諸如雞胚來源不固定，有外源病毒污染的可能等因素。以傳代動物細胞生產病毒疫苗抗原，可在短時間內增殖大量病毒，既能在短期內提供足夠數量的疫苗抗原，又能保證產品的效果和安全性，同時可以降低病毒在雞胚中連續傳代可能導致病毒變異的風險。

表2 MDCK懸浮細胞密度對H9亞型禽流感病毒抗原HA滴度的影響Tab 2 Effect of MDCK suspension cells density onHA titer of H9 subtype AIV antigen

表3 MDCK懸浮細胞制備的H9亞型禽流感病毒抗原EID50測定結果Tab 3 Results of the EID50titer of H9 subtypeAIV antigen prepared by MDCK suspension cells

有研究表明，禽流感病毒在MDCK細胞中能夠增殖穩定，適應性較強[8-9]，因此以MDCK細胞作為載體制備禽流感疫苗抗原越來越受到重視，其生物安全性也已經得到了世界各國的廣泛認可。早期很多學者[10-11]也對微載體培養禽流感病毒的方式進行了研究探索，采用微載體作為細胞附著基質增殖MDCK細胞生產禽流感疫苗抗原，步驟繁瑣、污染風險大、生產成本高，此外，由于微載體培養存在微載體處理，放大困難等諸多問題因此沒有能夠在禽用疫苗領域推廣。

全懸浮MDCK細胞的大規模培養，可以根據需求有效擴大細胞密度，解決疫苗產量低的問題，同時降低生產成本。本實驗中，采用逐漸降低血清含量直至無血清培養的方法，最終獲得了能夠在無血清培養基中培養的MDCK懸浮細胞株，此株細胞可以穩定增殖傳代，本研究掌握了一種從貼壁細胞到懸浮細胞馴化的方法，其他貼壁細胞的馴化也可借鑒此種方法。

文獻報道采用類似方法懸浮馴化細胞，細胞倍增時間約48 h[12]。本實驗所獲得的懸浮細胞倍增時間為24 h，在營養充足的條件下適應高密度生長，有利于縮短細胞的培養時間，對規?；a具有重要意義，并保持較高的活率，滿足增殖禽流感病毒的要求。

本實驗獲得的MDCK懸浮細胞株對H9N2 BX13株禽流感病毒敏感，將該病毒株以適量的MOI和適合的TPCK胰蛋白酶濃度接種細胞密度為1.0×106/mL～2.0×106/mL的細胞液時，接毒后72 h培養液的HA毒價可以達到7log2～9log2，每0.1 mL的EID50達到108.5，證明該細胞株適合用于禽流感病毒抗原的制備，可以作為制備禽流感病毒抗原的候選細胞株，該細胞株對禽流感病毒的增殖能力與MDCK貼壁細胞相當。陳宏等對重組禽流感病毒H5亞型Re-7在MDCK細胞上增殖條件的研究中報道[13]，貼壁細胞增殖病毒操作過程繁瑣，同一批次不同細胞瓶中病毒滴度存在差異，時間成本大。采用MDCK懸浮細胞繁殖病毒產量遠高于雞胚培養和貼壁細胞培養，并且同一批次病毒質量均一穩定，為后續生物反應器逐級放大培養制備禽流感疫苗奠定了基礎。

本研究通過逐步降低血清的方法使MDCK貼壁細胞適應無血清培養，獲得了能夠快速增殖并對H9亞型禽流感病毒敏感的MDCK純懸浮細胞株，該細胞株為將來規?；褂蒙锓磻魃a制備禽流感疫苗抗原奠定了基礎。