超量表達NrCN 煙草光合特征及煙葉化學成分分析

秦利軍，趙德剛

1.貴州大學農業生物工程研究院，貴陽市花溪區花溪二道 550025

2.貴州大學山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴陽市花溪區霞暉路1 號 550025

3.貴州省農業科學院，貴陽市花溪區金欣社區1 號 550006

自1983 年Zambryski 等［1］和Benfey 等［2］將根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti 質粒載體上的外源基因導入煙草細胞獲得第1 株轉基因植物以來，基因工程技術開創了植物遺傳改良的新紀元。利用該技術先后創制了γ-亞油酸（γ-linolenic acid，GLA）含量顯著增加的轉基因煙草（Nicotiana tabacum）［3］、番茄（Solanum lycopersicum）［4］和油菜（Brassica napus）［5］、耐鹽耐冷等非生物脅迫能力較高的轉基因作物［6-8］，抗Cercospora nicotianae 病害［9］以及低去甲基煙堿累積的轉基因煙草［10］。煙草病害是影響煙草生長發育和產量品質的重要因素，而煙草病害中以煙草花葉病毒（TMV）病在世界各煙區的流行性及破壞性最強［11］。因此，挖掘TMV 的抗性煙草種質，利用抗性基因對煙草進行遺傳改良是快速、經濟的新型育種手段之一［12］。早期分離鑒定的TMV 抗性基因包括黏煙草（Nicotiana glutinosa）的N 基 因［13］、普 通煙草（N.tabacum）Xanthi品種的NH基因［14］及N.tabacum Samsun品種的NL-C26基因［15］，其中N基因和NH基因已被廣泛應用于煙草的抗性育種研究中［16-17］。近年來，李梅云等［16］對不同類型煙草種質進行的TMV 抗性比較發現，黃花煙（Nicotiana rustica）及其雜交材料對TMV的免疫性最強。目前已報道的黃花煙（N.rustica）來源的TMV抗性基因為CN基因，分離自HZNH品種。該基因與早期研究的N基因擁有93.63%序列同源一致性的NrCN基因［17］，之后將NrCN 基因導入對TMV敏感的煙草中，發現NrCN 基因能顯著提高轉基因煙草對TMV 的抗性［18］。雖然利用這些優異抗病基因為創制和培育抗病毒煙草新種質提供了重要的育種策略，但獲得的轉基因生物通常存在諸多安全性的問題［19-20］。Qin 等［21］在前期研究的基礎上，引入了含有“Gene-deletor”的植物表達系統，實現了外源基因在轉基因煙草中的定向清除。可見，在提高煙草抗病性的同時，創制品質優質的煙草新種質尤為重要。為此，以前期試驗篩選獲得的T2代獨立轉基因煙草植株為材料，通過分析不同轉基因煙草株系對TMV的抗性，明確NrCN 導入對轉基因煙草光合特征和煙葉化學成分的影響，旨在篩選和培育優質抗病的煙草新種質。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料

供試材料：普通煙草K326（N.tabacum L.cv.K326）及3 個T1代獨立轉基因煙草株系Q1、Q2 和Q3 的種子［21］撒播于煙草育苗盤中進行漂浮育苗。轉基因煙草植株含有擬南芥（A.thaliana）葉片衰老特異表達基因AtSAG12 啟動子PSAG12，可驅動重組酶基因FLP 表達，并清除外源基因。普通煙草（N.tabacum）泛素蛋白基因Ubi 啟動子PUbi啟動外源篩選報告融合基因Gus::Bar 表達，以及普通煙草（N.tabacum）聚泛素蛋白基因Ubi.U4（GenBank：X77456.1）啟 動 子PUbi.U4驅 動 黃 花 煙（N.rustica）TMV 抗性基因NrCN 表達的3 組表達元件，植物表達載體圖譜見圖1。前期的研究結果Q1 和Q3 株系均含1 個外源基因拷貝（以擴增的部分Ubi.U4-NrCN 片段作為探針雜交得到），而Q2 株系含2個外源基因拷貝［21］。1.1.2 試劑與儀器

植物DNA Kit 購自天根（北京）生物科技有限公司；RNA Kit 購自美國OMEGA Bio-Tek 有限公司；DL 2000 DNA Marker 購自日本Takara（大連）生物公司；MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit、Power SYBR?Green PCR Master Mix 購 自 美 國Applied Biosystems 公司；可溶性糖測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；轉基因植株檢測及抗病相關基因表達分析引物均由上海旭冠生物科技有限公司合成；聚乙氧基月桂醚（brij-35）（北京拜爾迪生物公司）、十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）（分析純，西隴化工股份有限公司）、檸檬酸（C6H8O7·H2O）（重分析純，慶川東化工集團有限公司）、對氨基苯磺酸（C6H7NO3S）（天津市科密歐化學試劑有限公司）、二氯異氰尿酸鈉（C3O3N3Cl2Na）［阿法埃莎（天津）化學有限公司］、煙堿（C10H14N2，英國BDH 實驗室）、烤煙標準樣（中國煙草總公司青州煙草研究所）、對羥基苯甲酸酰肼（C7H6O3）（分析純，西隴化工股份有限公司）。

圖1 植物表達載體的構建圖譜Fig.1 A schematic diagram of plant expression vector

C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 儀 、PowerPac BasicTM凝膠電泳儀和凝膠成像儀ChemiDocTMXRS+（美國BIO-RAD 公司）；7500 熒光定 量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；LI-6400 光合測定儀（中國北京力高泰科技有限公司）；Alliance-Futura 連續流動分析儀（深圳市一正科技有限公司）；SKD-20S2 紅外石英消化爐（上海沛歐分析儀器有限公司）；Sherwood 420 火焰光度計（上海書俊儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 轉基因植株的鑒定

以3～5 葉期的轉基因和非轉基因煙草幼苗心葉為材料，進行GUS 組織化學染色。剪取煙苗心葉后浸沒于GUS 染色液并置于真空儀中，以25 kPa 抽真空15 min 后放入37 ℃恒溫培養箱中孵育過夜。次日依次用95%、75%、50%和20%乙醇梯度分別浸提葉片色素，以觀察GUS 染色結果。GUS 染 色 液 配 制：100 mmol·L-1Tris-HCl，0.5 mmol·L-1NaCl，0.02 mmol·L-1K3Fe（CN）6，50 mmol·L-1CH3OH，8.65 μmmol·L-1X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸）。按照植物DNA Kit 試劑盒操作說明書提取心葉GUS 染色陽性煙苗的總基因組DNA。以基因組DNA 為模板，利用引 物FUbi.U4（5’-AGGAGCCTCTTTGTTCCC-3’）和RUbi.CN（5’-TCATTCAAACACCACCTCG-3’）對特異性片段（Ubi.U4-NrCN）［807 bp，該片段含550 bp 普通煙Ubi.U4 啟動子（PUbi.U4）序列和257 bp 黃花煙NrCN 序列］進行擴增。PCR 擴增條件：94 ℃3 min；94 ℃20 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環；最終72 ℃保存5 min。

待漂浮盤上煙苗長至3～5 葉期時，每株系（轉基因和非轉基因）各取15 株長勢一致且生長良好的煙苗，分別移栽至含種植基質（菜園土∶Hawita 泥炭土=3∶1）的花盆（高16 cm，直徑20 cm，種植基質10 kg）中。每盆施1～2 g 復合肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶12）作為底肥，盆栽期間追肥1 次。煙草植株在相對濕度為70%～80%，16 h 光照/8 h 黑暗，25～28 ℃條件下培養。煙苗移栽后45 d 時，參照標準方法［22］進行煙草農藝性狀指標的測定。

1.2.2 TMV 接種及NrCN 基因表達分析

參照Kasschau 等［23］的半葉枯斑法以6～8 葉期T2代轉基因植株（Q1、Q2 和Q3）與非轉基因煙苗自下向上數第3 片完展葉進行摩擦接種，每個株系各接種3 株煙。接種后的煙株置于人工培養箱中，在光照1 600～1 800 Lx，溫度25～27 ℃，相對濕度＞80%的培養條件培養5 d。之后取煙株（每株系均取3 株）接種部位的臨近葉片0.1 g，參照植物RNA Kit 及Reverse Transcriptase Kit 操作說明書提取總RNA，并反轉錄為cDNA。以煙草肌動蛋白基因β-Actin 為內參基因，用Real-time PCR 分析cDNA 模板中NrCN 基因的相對表達量，每個株系設置3 次重復。NrCN 及β-Actin 特異性擴增引物序列見表1。

表1 Real-Time PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time PCR

1.2.3 轉基因煙草煙葉化學成分的測定

1.2.3.1 煙葉取樣及預處理

取移栽后50～60 d 的煙株自下向上數13～15 葉位（3 片）煙葉混合后，參照標準方法［24］對煙樣進行烘干預處理。混合煙葉置于臺式電熱恒溫鼓風干燥箱［HWXT-9245A，深圳AODEMA（澳德瑪）公司］中于110 ℃殺青10 min，再將溫度調至80 ℃左右烘至恒質量，用于煙葉化學成分分析。分別取打頂后10 d 和非打頂煙株的相同葉位葉片，按照標準方法［24］（略有改動）進行樣品處理與分析，煙葉烘干后放入粉碎機中進行粉碎、研磨，過0.425 mm（40 目）網篩，密封保存備用。每個株系（轉基因和非轉基因）均選取3 株煙。

1.2.3.2 煙葉化學成分的測定

用Denver Instument 電子天平（0.1 mg，北京丹佛儀器有限公司），精確稱取干燥煙粉樣品0.25 g至50 mL 的具塞錐形瓶中，參照標準方法［25］測定煙葉總植物堿含量（質量分數）；稱取0.10 g 煙粉樣品于消化管中，按照標準方法［26］測定煙葉總氮含量（質量分數）；稱取煙粉樣品0.25 g 至50 mL 的具塞錐形瓶中，加入25 mL水后于室溫下振蕩萃取30 min，參照標準方法［27］測定煙葉鉀離子含量（質量分數）；稱取煙粉樣品0.25 g 至50 mL 的具塞錐形瓶中，加入25 mL 水后于室溫下振蕩萃取30 min，按照標準方法［28］測定煙葉氯離子含量（質量分數）。每株煙樣重復測定3次，取3次重復的平均值。

1.2.4 轉基因煙草煙葉可溶性糖及光合特征指標的測定

準確稱取煙樣粉末0.1 g，分別加入1 mL 蒸餾水混勻成勻漿，然后倒入有蓋的離心管中，95 ℃水浴處理10 min（蓋緊，以防止水分散失）。冷卻后，以8 000 g、25 ℃離心10 min，取其上清液至10 mL 的試管中，再用蒸餾水定容到10 mL，搖勻后備用。按照可溶性糖測定試劑盒說明書進行測定和計算煙樣中可溶性糖含量，每株煙樣重復測定3 次，取3 次重復的平均值。

利用LI-6400 光合測定系統測定團棵期（移栽后45 d）煙草自下向上數第6 片完展葉的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和水分利用率（WUE）等指標。測定條件：紅藍光源，葉室溫度設定為28 ℃，氣體流量500 μmol·s-1，CO2濃度變化范圍為377～400 μmol·mol-1。光合有效輻射（PAR）分別設置為1 000、1 300 和1 500 μmol·m-2·s-1，再按照設定要求從PAR 值由高至低的順序進行測定，繪制PAR光合響應曲線，每株煙樣重復測定3 次，取3 次重復的平均值。

1.2.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2003 及SPSS 16.0 軟件進行數據處理，數據均表示為平均值±標準差（SD）。采用統計方法中獨立樣本T 檢驗，測定各組間差異的顯著性。

2 結果與討論

2.1 轉基因煙草的鑒定

對3～5 葉期T2代轉基因煙草植株GUS 染色和PCR 擴增檢測，共篩選獲得轉基因煙草植株38 株，其中Q1 株系13 株、Q2 株系10 株和Q3 株系15 株，見圖2。另外，對團棵期的3 個獨立轉基因株系和非轉基因株系的農藝性狀指標調查發現，株高、葉片數等農藝指標均無明顯差異。

Q1、Q2、Q3.不同的轉基因株系；TP、WT.分別為轉基因和野生型植株；M.DL 2000 DNA marker；P.陽性對照；N.陰性對照；A.不同煙草植株生長表型；B.煙草植株的GUS 染色圖；C.轉基因煙草的PCR 鑒定圖

2.2 TMV 接種對轉基因煙草NrCN 表達的影響

TMV 接種轉基因3 個煙草株系（Q1、Q2 和Q3）后，煙草植株接種葉片均形成抗病壞死斑，而非轉基因植株未見壞死斑形成。推測NrCN 的導入誘導了轉基因煙草產生免疫應答反應，進而通過壞死斑的形成而抑制TMV 的擴散。這與前人對野生型黏煙草（N.glutinosa）中TMV 抗性N 基因介導的抗病作用機制的研究結果相似，即TMV 的侵入引起了N 基因表達量的顯著上調［13］。通過接種試驗發現，接種第5 天時Q2 植株出現的壞死斑最多，Q1 植株次之（圖3A）。進一步對NrCN 基因的qRT-PCR 分析表明，接種前非轉基因和轉基因煙草均有NrCN 的表達，但該基因在兩種植株中表達量均較低，隨著接種后時間的推進，Q1、Q2 和Q3 植株中NrCN 基因表達量有不同程度增加，其中以Q2 株系中NrCN 表達量最高（擴增條帶最亮）。非轉基因煙草接種前后均檢測到NrCN 基因的表達，推測非轉基因煙草中可能存在與NrCN基因同源且無抗病功能的基因（圖3B 和3C）。推測Q2 株系形成較多數量的壞死斑可能與NrCN 在Q2 株系中的多拷貝有關，而基因拷貝數與其表達量間存在一定的聯系。Li 等［29］研究發現，短日生長豌豆（Pisum sativum）花后特異基因PPF1在轉基因水稻中存在多拷貝，可引起PPF1基因表達受到抑制，拷貝數與基因表達量表現出負向相關。而本研究中多拷貝的NrCN 出現了高表達量，兩者又表現為正向相關，這可能是由于外源基因在宿主染色體插入位點不同或是由于這些基因的啟動子受特異因子調控啟動引起的表達差異造成的。

圖3 煙草植株接種TMV 表型比較及NrCN 基因表達量分析Fig.3 Phenotype and NrCN expression levels of transgenic tobacco inoculated TMV

2.3 NrCN 基因對轉基因煙草化學成分的影響

由圖4 可以看出，除Q1 株系外，打頂前轉基因Q2 和Q3 株系的總植物堿（以煙堿計）和總氮含量均顯著低于非轉基因植株。打頂引起了所有煙草植株的總植物堿積累量增加，其中以Q1株系增幅最大，為59.5%，Q3 株系次之，為28.7%，Q2 株系最低，為18.2%（圖4A）。盡管打頂增加了煙株總植物堿的積累量，但Q2 和Q3 株系打頂后其總植物堿含量仍顯著低于非轉基因煙草。打頂前，轉基因株系Q2 和Q3 的總氮含量也顯著低于非轉基因植株和Q1 株系，打頂后各植株的總氮含量均有不同程度下降，Q1 株系總氮含量高于非轉基因植株12.6%，Q2 株系總氮含量低于非轉基因植株7.6%（圖4B），說明不同轉基因植株在應答打頂處理時調節總氮含量的能力存在一定差異。其中Q2 株系推測可能是由于多拷貝基因的插入破壞了植物堿合成的相關基因，最終導致了總植物堿含量顯著下降。打頂未顯著增加總植物堿的積累量，這暗示著Q2 株系中總植物堿合成受到了一定抑制。同樣，打頂也引起各煙草株系中鉀離子含量下降，打頂后除Q1 株系鉀離子含量顯著高于非轉基因植株外，其余2 個轉基因株系中鉀離子含量與非轉基因植株無顯著差異（圖4C）；在煙株打頂前后，轉基因Q2 株系的氯離子含量均顯著高于Q1、Q3和非轉基因植株，且打頂引起的氯離子含量降幅最小，僅為非轉基因植株的7.58%（圖4D），說明NrCN 基因的多拷貝還導致了Q2 株系中Cl-含量提高，而過高的氯離子含量又會影響煙葉的品質［30］。不同煙草株系可溶性糖含量的測定結果（圖5）表明，除Q3 株系外，Q1 和Q2 株系可溶性糖含量分別表現為顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）高于非轉基因植株（14.82 mg·g-1），分別為21.88 和16.85 mg·g-1。

圖4 NrCN 基因對煙草煙葉化學成分的影響Fig.4 Effects of NrCN on tobacco leaf chemical compositions

圖5 打頂前不同煙草株系可溶性糖含量的比較Fig.5 Soluble sugar contents in different tobacco plants before topping

2.4 轉基因植株光合作用指標

圖6 打頂前不同煙草株系光合特征指標的比較Fig.6 Photosynthetic indexes in different tobacco plants before topping

各煙草株系在一定光強范圍（1 000～1 500 μmol·m-2·s-1）內的光合特征指標測定結果（圖6）表明，Q2 株系的Pn 值顯著低于Q1、Q3 和非轉基因株系。低光強時（1 000 μmol·m-2·s-1）Q1 株系和非轉基因植株Pn 值相當，均顯著高于Q3 株系；當光強增加至1 300 μmol·m-2·s-1時，Q1、Q3和非轉基因植株的Pn 值差異不顯著；但當光強增加到1 500 μmol·m-2·s-1時，非轉基因植株的Pn值顯著高于轉基因植株（圖6A）。在光強1 000～1 500 μmol·m-2·s-1范圍內，Q2 株系的氣孔導度值顯著低于其他3 個株系，且非轉基因株系的Gs 值在光強為1 000、1 300 和1 500 μmol·m-2·s-1時均顯著高于Q1 株系；除在光強1 300 μmol·m-2·s-1時Q3 株系Gs 值顯著高于非轉基因植株外，低光強（1 000 μmol·m-2·s-1）和高光強（1 500 μmol·m-2·s-1）均低于非轉基因植株，差異達到顯著水平（圖6B）。同樣，光照強度在1 000～1 500 μmol·m-2·s-1范圍時，Q2 株系的蒸騰速率值也顯著低于其他3個株系。在低光照強度（1 000 μmol·m-2·s-1）時，Q1 株系的蒸騰速率最高，為2.5 μmolH2O·m-2·s-1；非轉基因株系次之，為2.5 μmolH2O·m-2·s-1；Q2 株系最低，為0.7 μmolH2O·m-2·s-1。隨著光照強度的增加，除Q1 株系的Tr 值下降外，Q2、Q3 和非轉基因株系的Tr 值均增加，后兩者的蒸騰速率值始終高于前者，差異達到顯著水平（圖6C）。因此，在設定光強范圍（1 000～1 500 μmol·m2·s-1）內Q2株系中的多拷貝NrCN 基因導致植株Pn、Gs 和Tr的顯著下降，推測導致這一現象的原因可能是由于過量NrCN 基因表達引起CN 蛋白的顯著積累。而后者作為免疫應答的重要組分，若含量過高時可能會引起轉基因植株長期處于一種免疫應答的應激狀態，轉基因植株勢必會通過下調光合作用以消除由免疫應激引起的高強代謝水平，進而調節植株的生理平衡。在本試驗光照強度范圍內，WUE 指標在Q2 株系中顯著高于轉基因Q1、Q3 和非轉基因株系。當光照強度達1 500 μmol·m2·s-1時，轉基因植株的WUE 均顯著高于非轉基因植株，說明光照強度高時，NrCN 基因的導入又可通過提高轉基因植株對水分的利用來平衡植物體的光合效率。也說明不同轉基因株系在應答不同光照強度誘發的光合作用時，由于外源基因拷貝數及插入染色體位置不同，使不同轉基因植株表現出光合特征指標變化方面的差異。此外，有研究表明，植株中K+含量與光合作用也存在一定的關系，轉基因煙株鉀含量積累能力的差異可能也會引起各轉基因植株光合特征指標的改變［31-32］。

可見，Q2 株系比Q1 和Q3 株系的抗病性強且綜合品質較好，但鑒于前期研究結果表明該株系為多拷貝轉基因植株，不利于作為親本材料進行育種試驗。因此，結合抗病性和煙葉品質分析結果，確定Q1 株系作為親本材料更有利于培育抗TMV 且煙葉品質優良的種質或品種。

3 結論

以含TMV 抗性NrCN 基因的煙草為材料，在人工培養箱和溫室條件下的試驗結果表明，轉基因煙草均能較好地應答TMV 感染，且對不同株系品質的影響存在一定差異。其中轉基因Q1 株系（含單拷貝抗病NrCN 基因）與非轉基因野生型栽

培煙草相比，煙草抗病性顯著提高，煙葉總植物堿、總氮及鉀離子含量等化學成分指標均達到或高于非轉基因野生型栽培煙草。另外，Q1 株系在低光強（1 000 μmol·m2·s-1）時其Pn、Gs 和Tr 值均顯著提高，但隨著光強的增強這3 個光合作用指標值又逐漸降低，說明低光照強度即可滿足Q1株系的光合作用。因此，Q1 轉基因煙草株系可作為培育抗病優質煙草新種質或新品種的理想親本材料。