CRISPR/Cas9介導敲除小鼠成纖維細胞MMP-2基因

接金磊,遲 良,張青青,李鵬輝,劉煥奇

(青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島266109)

MMP-2(金屬基質(zhì)蛋白酶-2)是一種重要的炎性介質(zhì)，能夠參與多種疾病的發(fā)展過程[1]。炎癥早期釋放的TNF-α和IL-6等炎性介質(zhì)能夠促進MMP-2的表達[2，3]，而過表達的MMP-2可降解細胞外基質(zhì)，破壞基膜，使炎性細胞進一步浸潤到更深層次的組織中，出現(xiàn)肌纖維壞死及吞噬現(xiàn)象等一系列病理炎癥改變，從而加重炎性反應[4]。另外，腫瘤細胞也可因基膜的破壞、細胞外基質(zhì)的溶解發(fā)生轉(zhuǎn)移[5]。

近幾年有研究表明[6]，金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)在蹄葉炎的早期發(fā)展階段中起著重要作用，基質(zhì)金屬蛋白酶能催化降解基底膜、半橋粒等重要結構，最終使基底膜和上皮基部細胞分離，使薄膜組織失去其生物學功能[7]，造成指(趾)損傷，并發(fā)現(xiàn)P38 MAPK有利于MMP-2的活化[8]，其下游通過PI3K/Akt使半橋粒調(diào)節(jié)異常，粘附功能失常[9]，對蹄葉炎具有強大的促進作用。并有大量研究[10-12]表明，在蹄葉炎的早期炎癥是主要的病理變化，這些變化包括：激活蹄層狀基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、活化血小板并且形成嗜中性粒細胞血小板聚集、蹄葉層的白介素-1(IL-1)和內(nèi)皮素1表達增加、p38 MAPK表達增加等。其中被激活的白細胞和血小板會釋放TNF-α和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，p38 MAPK能夠激活MMP-2，從而對蹄葉層造成破壞，促進蹄葉炎的發(fā)生。

隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，奶牛蹄葉炎也越來越多。據(jù)統(tǒng)計，41%的肢蹄病是蹄葉炎，72%的奶牛至少有一個蹄發(fā)生過蹄葉炎[13]。并且在實際情況中，對急性蹄葉炎的及時治療是不切實際的，因為在其造成損傷前確診是不可能的。當奶牛發(fā)展到慢性蹄葉炎時康復的幾率很小，到目前為止還沒有確切診斷蹄葉炎的基因檢測指標，往往在癥狀上發(fā)現(xiàn)蹄葉炎癥狀時該奶牛已經(jīng)面臨淘汰危險。因此，開展對奶牛蹄葉炎病因、發(fā)病機理、診斷和防治等方面的研究，對防治奶牛蹄葉炎、提高奶牛生產(chǎn)性能具有重要的實用價值和現(xiàn)實意義[14]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種存在于細菌和古細菌中針對外來入侵的免疫防御系統(tǒng)，能夠識別外來入侵的核酸物質(zhì)并形成針對性的剪切，以此來抵抗入侵的病毒以及外源DNA[15]。該技術操作簡單、適用范圍廣[16]，可以對特定的基因進行編輯，并且效率很高，在基因功能研究、模式生物構建、新品種的改造和培育以及基因治療等方面均有研究[17]。本試驗目的是通過利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除小鼠成纖維細胞中的MMP-2基因，為后人研究MMP-2與蹄葉炎炎癥提供理論基礎，對蹄葉炎等炎癥性疾病的治療預防和快速診斷具有重要意義，并為尋找分子指標的變化與蹄葉炎的關系，從而進行準確診斷和早期預警提供理論基礎和技術標準。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒 Lenticrispr v2載體，購自Addgene公司；Stbl3感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶 Esp3I和FastAP，均購自Thermo公司；二硫蘇糖醇 DTT，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4多聚核苷酸激酶和Quick Ligase連接酶，均購自NEB公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，均購自TaKaRa公司；2×TaqPCR Master Mix，購自北京艾德萊生物科技有限公司；青鏈霉素，購自Solarbio公司；DMEM-F12，購自HyClone公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒和堿性磷酸酶顯色試劑盒，購自貝博生物有限公司。

1.3 sgRNA的設計與相關引物的合成 根據(jù)MMP-2的基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_008610.3)利用在線sgRNA設計工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)設計MMP-2的sgRNA(small guide RNA)，并在序列正義鏈和反義鏈的5′端添加Esp3I酶切位點(CACC/AAAC)，設計的sgRNA引物分別為：MMP-sgRNA2-F：5′-caccGGCGATGGTGCAGCGATGGCG-3′；MMP-sgRNA2-R：5′-aaacCGCCATCGCTGCACCATCGCC-3′；MMP-sgRNA3-F： 5′-caccGTGGTAAACAAGGCTTCATGG-3′；MMP-sgR NA3-R：5′-aaacCCATGAAGCCTTGTTTACCAC-3′。sgRNA 的磷酸化與退火反應體系為：100 μmol/L Oligo1 1 μL、100 μmol/L Oligo 21 μL、10×T4 Ligation Buffer 1 μL、ddH2O 6.5 μL、T4 PNK 0.5 μL，共10 μL體系。反應條件為：37 ℃ 3 min，90 ℃ 5 min，再放置室溫下，自動冷卻至25 ℃。最終退火的寡核苷酸用無菌水以1∶200倍稀釋，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 lenticrispr v2載體酶切 用Esp3I限制性內(nèi)切酶切割Lenticrispr v2質(zhì)粒，酶切體系為：Lenticrispr v2 5 μg、Esp3I 3 μL、Fast AP 3 μL、10×Fast Digest Buffer 6 μL、100 mol/L DTT 0.6 μL、ddH2O X μL，共60 μL體系。反應條件為：37 ℃水浴0.5～1 h。將酶切產(chǎn)物進行電泳檢測，切膠回收酶切后的載體。

1.5 Lenticrispr-sgRNA載體構建 把退火之后200倍稀釋的DNA片段與酶切后膠回收的載體相連接。連接反應體系為：酶切載體1 μL、DNA片段1 μL、2×Quick Ligase Buffer 5 μL、ddH2O 3 μL、Quick Ligase 1 μL，共11 μL體系。反應條件為：25 ℃孵育30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞stbl3，涂于含有氨芐抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進行菌液PCR檢測，檢測引物為：V2-JC2-F：5′-GCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3′；V2-JC2-R：5′-ACATCACTTTCCCAGTTTACCC-3′。菌液PCR體系為：菌液 2 μL、2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL、v2-JC2-F 0.5 μL、v2-JC2-R 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL，共25 μL體系。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將陽性PCR反應液送公司測序，提取質(zhì)粒。

1.6 轉(zhuǎn)染及Western Blot 檢測 轉(zhuǎn)染前1天，將小鼠成纖維細胞接種于六孔板，加入2 mL含10%胎牛血清不含雙抗培養(yǎng)基；取4支無菌離心管，分別加入200 μL無血清無雙抗培養(yǎng)基，再向1號離心管中加入15 μL生理鹽水；2、3號離心管中分別加入3 μg構建好的Lenticrispr-sgRNA2、Lenticrispr-sgRNA3載體；向4號離心管中加入相同量的Lenticrispr v2質(zhì)粒；最后在上述4個離心管中分別加入9 μL轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育15 min。將上述混合液加入六孔板中，48 h后更換為含有1 μg/mL嘌呤霉素10%胎牛血清不含雙抗的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。提取細胞蛋白，做Western Blot 檢測MMP-2蛋白表達量。

2 結果

2.1 Lenticrispr v2載體的酶切 Lenticrispr v2質(zhì)粒長度為14 873 bp，用Esp3I限制性內(nèi)切酶切割Lenticrispr v2質(zhì)粒，可以切割下1個2 000 bp左右大小的條帶。由圖1可以看出，將酶切反應液進行凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)2個條帶，其中1條2 000 bp左右與預測的結果相符。

圖1 lenticrispr v2載體酶切鑒定

1: Lenticrispr v2原質(zhì)粒； 2：Lenticrispr v2質(zhì)粒酶切，切膠回收后；3：Lenticrispr v2質(zhì)粒酶切后； M1、M2：DNA相對分子質(zhì)量標準

2.2 Lenticrispr-sgRNA載體構建 DNA片段與酶切后膠回收的載體相連接，如封三彩版圖2。

2.3 陽性克隆鑒定 挑去陽性菌落進行菌液PCR，并將PCR體系進行凝膠電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)500 bp左右的目的條帶，結果如圖3所示，與預測的結果相符。

圖3 陽性菌落PCR鑒定

M: DNA相對分子質(zhì)量標準； 1、2：陽性菌落PCR反應液

2.4 測序結果 將PCR產(chǎn)物送至公司測序，得到產(chǎn)物序列，含有sgRNA：

Lenticrispr-sgRNA2：5′-…ACGAAACACCGGCGATGGTGCAGCGATGGCGGTTTTA…-3′

Lenticrispr-sgRNA3：5′-…ACGAAACACCGTGGTAAACAAGGCTTCATGGGTTTTA…-3′

2.5 轉(zhuǎn)染結果 由封三彩版圖4可見，經(jīng)嘌呤霉素篩選后1組(對照組)細胞全死，2、3、4組細胞生長良好，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

2.6 Western Blot 圖5結果顯示,基因敲除組(Lenticrispr-sgRNA2組和Lenticrispr-sgRNA3組)的MMP-2蛋白表達量明顯降低，與空白對照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組均有顯著差異(P<0.05)。

圖5 MMP-2蛋白表達量分析

3 討論

經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，將Lenticrispr v2載體用Esp3I酶進行酶切時，在PCR儀中酶切效果不如在水浴鍋中。在試驗中酶切時間可適當延長，但不要超過Esp3I酶的有效作用時間(6 h)，若超過Esp3I酶的有效作用時間會把載體切碎，得不到所需片段。在對酶切好的載體進行切膠回收、純化時，要用能夠切膠回收的核酸染料(如溴化乙錠(EB))，在紫外線下不容易淬滅，以免造成切膠回收時載體濃度過低導致載體構建失敗。本試驗中酶切載體時對載體進行脫磷而Oligo則進行加磷處理之后再進行連接，這樣可充分保證載體不會自連。其實Lenticrispr v2載體酶切后兩端沒有互補序列，所以不進行脫磷也不會自連，但并沒有文獻說明不脫磷對載體構建成功率是否有影響。

在轉(zhuǎn)化過程中培養(yǎng)超過16 h就很容易出現(xiàn)衛(wèi)星菌落和假陽性并且有提不出質(zhì)粒的現(xiàn)象，這可能與帶Amp抗性的細菌在生長時為了抵抗Amp會分泌一種能夠降解Amp的β-內(nèi)酰胺酶有巨大的關系。隨著帶Amp抗性細菌的生長，β-內(nèi)酰胺酶分泌增多，培養(yǎng)基中的Amp逐漸減少，一旦細菌失去選擇壓力，就可能造成質(zhì)粒丟失，當Amp濃度降到很低不足以抑制雜菌生長時，未攜帶質(zhì)粒的菌就會比帶質(zhì)粒的快，出現(xiàn)較多的假陽性。其次也有可能是構建好的載體拷貝數(shù)低，提取DNA量低，檢測不出來。在試驗中一開始平板中Amp濃度為50 μg/mL，有較多的假陽性和衛(wèi)星菌落，后來Amp濃度增加為100 μg/mL，衛(wèi)星菌落和假陽性明顯減少。

轉(zhuǎn)染時應選用活力旺盛的細胞，不要用含雜質(zhì)較多的原代細胞，最好是第3～5代的細胞，可以大大增加轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染時小鼠成纖維細胞在六孔板中生長密度為80%～90%時使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，有研究表明,細胞轉(zhuǎn)染效率主要受細胞狀態(tài)、細胞生長密度、質(zhì)粒濃度、脂質(zhì)體以及轉(zhuǎn)染時間有關[18]，經(jīng)本試驗篩選用3 μg載體與9 μL脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染效果較好。小鼠和牛MMP-2基因的mRNA序列具有高同源性，本試驗敲除小鼠成纖維細胞MMP-2基因，為以后在細胞層次研究MMP-2對炎癥的影響提供基礎。

4 結論

本試驗構建了MMP-2基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，成功敲除小鼠成纖維細胞中MMP-2基因，為進一步在細胞層面研究MMP-2基因提供基礎。