枯草芽孢桿菌對鎘暴露鯽魚鎘代謝及抗氧化的影響

王云翔，尹玉偉，尹玉林，程 義，秦 悅，王 楠，李月紅

(吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春130118)

鎘(Cadmium, Cd)是一種對動植物危害巨大的重金屬，被廣泛的應用于電池、電鍍、顏料等眾多制造環節。鎘是生命過程的非必需元素，因此鎘進入動植物機體后會造成嚴重的損傷[1]。我國《漁業水質標準》(GB11607-89)規定水中鎘濃度需低于0.005 mg/L[2]。

鎘中毒的治療主要是通過使用螯合劑，而螯合劑較大的副作用，使其使用受到較大的限制[3]。益生菌具有較高的抗逆性以及重金屬耐受性，其對動物重金屬中毒有一定緩解作用[4]。研究表明，乳酸菌具有較好的耐重金屬(主要是鎘和鉛)作用，同時對于動物的急性或慢性鎘中毒都能夠有一定緩解作用[5-6]。枯草芽孢桿菌被廣泛應用于畜牧養殖中，而其對于重金屬減毒作用研究較少，對于鎘毒性緩解作用研究更少。本試驗將枯草芽孢桿菌和不同劑量的鎘分別加入飼料和水中暴露鯽魚，測定組織中鎘濃度及抗氧化指標，為枯草芽孢桿菌減鎘毒性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康鯽魚300條，平均體重55 g±0.74 g，由新立城水庫提供。試驗前置于80 L玻璃缸中適應7 d。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 氯化鎘(CdCl2·2.5 H2O )、高氯酸、硝酸和氯化鈉，購自北京化工廠； 瓊脂、酵母提取物和胰蛋白胨，購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒，均購自南京建成生物有限公司。

1.2.2 主要儀器 全波長酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；火焰原子吸收分光光度計，日本島津公司；低溫高速離心機，貝克曼庫爾特公司。

1.2.3 鎘溶液的配制 鎘母液配制：稱取20.31 g氯化鎘，充分溶于1 L的蒸餾水中，轉至玻璃瓶中保存備用。

1.3 試驗設計

1.3.1 枯草芽孢桿菌耐鎘試驗 配制含有梯度鎘(100 mg/L～700 mg/L)的LB培養板，將枯草芽孢桿菌涂于培養板上，進行最大耐鎘濃度測定。將6.4×109CFU/mL的液體LB稀釋后涂于梯度鎘板上，培養12 h觀察枯草芽孢桿菌的生長情況。

1.3.2 動物試驗 經適應7 d的鯽魚，隨機分成6組，對照組(C0S0)，枯草芽孢桿菌組(C0S1)：飼料中只添加108CFU/g的枯草芽孢桿菌；低濃度鎘組(C1S0)：在水中只添加0.5 mg/L的鎘；枯草芽孢桿菌治療1組(C1S1)：飼料中添加108CFU/g的枯草芽孢桿菌和在水中添加0.5 mg/L的鎘；高濃度鎘組(C2S1)：在水中只添加1 mg/L的鎘；枯草芽孢桿菌治療2組(C2S1)：飼料中添加108CFU/g的枯草芽孢桿菌和在水中添加1 mg/L的鎘。試驗期間，每天9點和18點飼喂2次，飼喂量為魚體重的1%～2%，每缸水為80 L，每2 d換水1次，換水量為總體積的1/3，水溫維持在23 ℃±2 ℃，水中的溶氧為7.2 mg/L，試驗周期為60 d。

1.4 測定指標以及方法

1.4.1 樣品采集 試驗結束后，進行組織樣品的采集，分別采取鯽魚的鰓、肝臟、胰臟、腸道、腎、脾臟和肌肉組織。采樣前先用麻醉劑將鯽魚進行麻醉，放于冰袋上進行解剖，采集后的組織用無菌生理鹽水進行沖洗，濾紙吸干后放于-80 ℃保存。

1.4.2 組織鎘濃度測定 將采集的組織，用雙蒸水清洗，55 ℃烘干，稱取重量，加濃硝酸進行酸解后使用高壓微波爐進行消解，消解后定溶于20 mL的容量瓶中，使用火焰原子吸收分光光度計測定鎘濃度，最后計算組織中鎘濃度。

1.4.3 組織氧化指標測定 準確稱取組織的重量，將組織剪碎后加入一定量冰冷的生理鹽水，冰浴勻漿，3 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清待用。SOD、GSH、GST各指標按照試劑盒說明書進行測定。

1.5 數據分析 試驗結果采用SPSS20.0軟件進行處理，組間采用單因素方差分析，兩兩對比采用LSD分析，以P< 0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 枯草芽孢桿菌對鎘耐性結果 枯草芽孢桿菌對鎘耐性結果(圖1)，從結果中看出，隨著培養基中Cd濃度增加，枯草芽孢桿菌的菌落逐漸變小和變少，當Cd濃度達到300 mg/L時，枯草芽孢桿菌不再生長。

圖1 枯草芽孢桿菌對鎘耐性結果

A：對照組；B：100 mg/L鎘；C：200 mg/L鎘；D：300 mg/L鎘

2.2 組織中鎘濃度測定 由表1可知，組織中鎘濃度量大小依次是：鰓>腎>腸>肝>肌肉；同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟、腎、腸和鰓組織中鎘含量顯著降低(P<0.05)；肌肉組織鎘濃度，高濃度鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組差異顯著(P<0.05)。

表1 鯽魚各組織鎘含量

注：同一列數據中，肩標有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，肩標有相同字母的表示差異不顯著(P>0.05)

2.3 肝臟抗氧化指標測定

2.3.1 肝臟SOD指標 由圖2可知，同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟SOD活性顯著升高(P<0.05)。

圖2 鯽魚肝臟中SOD變化

2.3.2 肝臟GSH指標 由圖3可知，低劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟GSH活性顯著升高(P<0.05)；高劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟GSH活性差異不顯著(P>0.05)。

圖3 鯽魚肝臟中GSH變化

2.3.3 肝臟GST指標 由圖4可知，同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟GST活性顯著降低(P<0.05)。

圖4 鯽魚肝臟中GST變化

3 討論

枯草芽孢桿菌能夠提高畜禽的飼料轉化率，改善宿主腸道微生態平衡，提高免疫力，被廣泛的應用于畜牧水產中。此外，其還有具有較高的抗逆性，在處理水環境中也具有很廣泛的應用，程靜等研究發現，在水體中枯草芽孢桿菌對鎘最大的耐受為50 mg/L,同時其對水體中的鎘具有較高的吸附去除作用[7]。本試驗研究發現，枯草芽孢桿菌的最大耐鎘濃度在200 mg/L～300 mg/L之間，可能是由于本文所用的菌為鯽魚養殖池底泥中分離，對鎘有較高的耐受性。

鎘進入機體后，能夠與鐵、鋅等元素競爭細胞內抗氧化酶的結合位點，導致抗氧化功能的損傷[8]；同時還會破壞硫醇氧化還原平衡，從而導致細胞谷胱甘肽含量降低[9]；上述機制會誘導氧活性自由基(ROS)的過量產生，引起機體的氧化應激反應[10-11]。此外，鎘還能夠顯著刺激金屬硫蛋白(MT)的表達，當水生動物暴露重金屬后，MT基因在不同組織中的表達與重金屬的暴露存在顯著的相關性，也因而被用來作為生物標記物來檢測水環境中重金屬的污染[12-13]。Kim等通過利用維生素C和鉛同時暴露許氏平鲇后發現，維生素C能夠減少鉛的積累，而組織中的鉛濃度依次為：腎>肝>脾 >腸>鰓>肌肉。本試驗中，組織中鎘濃度依次為：鰓>腎>腸>肝>肌肉，這與攻毒方式有關[14-15]，本試驗的攻毒方式為將鎘加入水中，而Kim是將鉛加入飼料中，枯草芽孢桿菌對鎘有一定的耐受性，同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟、腎、腸和鰓組織中鎘含量顯著降低(P<0.05)；肌肉組織鎘濃度，高濃度鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組差異顯著(P<0.05)，這可能與枯草芽孢桿菌在鯽魚腸道內對鎘進行吸附，從而降低了腸道內的鎘濃度，進而減少了對鎘的吸收有關，也可能與枯草芽孢桿菌調節了MT基因的表達有關，具體機制需要進一步研究。組織中鎘濃度降低，有利于機體正常代謝的進行，因此，抗氧化指標得到了一定的提升，同時枯草芽孢桿菌的代謝產物能夠進入機體，對抗氧化能力也有一定的提升作用。

綜上所述，枯草芽孢桿菌具有較高的耐鎘能力，同時能夠促進鎘暴露鯽魚后組織中鎘的代謝速度，此外，對于鎘暴露的氧化應激有一定的修復作用。