豬重要病毒性病原多重PCR檢測方法建立及應用

王朋沖，姜艷芬，周宏超，李春燕，李鑫鑫，羅麗華，馮 秀，郭抗抗

(西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌712100)

目前對養豬業危害最大的主要是病毒性傳染病，常見的病原有豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV2)，偽狂犬病病毒(PRV)和豬細小病毒(PPV)等。CSFV引發的豬瘟(CSF)是豬的一種高度傳染性病毒性疾病，傳染性強、死亡率高、經濟損失大[1-2]；PPV能引起母豬產死胎、弱胎、木乃伊胎，感染豬場會經常出現母豬繁殖失敗的現象[3]。PRV、PCV2、PRRSV除了導致感染發病豬死亡外，還會造成豬群隱性感染，豬群長期帶毒[4]。臨床上準確檢測這些病毒是對其有效防控的基礎，目前豬群很少存在單一病原感染的情況，多種病原的混合感染或繼發感染較為常見[5-6]。病毒檢測常用的實驗室方法有病毒的分離鑒定、血清學檢測、免疫學檢測、分子生物學檢測等。分子生學技術由于具有快速、操作簡單、結果可靠、敏感性高等優勢，在畜禽病毒檢測中廣泛應用，應用最多的是聚合酶鏈式反應(PCR)技術，以及在其基礎上發展產生的各項技術，如反轉錄PCR、多重PCR、實時定量PCR等[7]。多重PCR技術就是在一個反應體系中加入針對不同病原的特異性引物，可以實現一個反應檢測多個病原的目的，具有高通量檢測的優勢而被廣泛的應用于病原的檢測[8-9]。

在豬場疾病防控和調研工作中，我們發現一些豬場存在多種病毒感染的情況，主要有CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV，需要建立快速、敏感的檢測方法。結合對豬場病毒性病原感染情況的調查，針對豬場和基層單位技術能力，分別建立了核酸為RNA的CSFV和PRRSV的雙重RT-PCR檢測方法，核酸為DNA的PCV2、PRV和PPV的三重PCR檢測方法，為這些病毒的快速、大批量檢測提供了可供選擇的方法。

1 材料與方法

1.2 病毒和血清樣品 豬瘟病毒石門株滅活毒、PRRSV美洲株、PRV、PPV、PCV2、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)均由西北農林科技大學動物醫學院獸醫公共衛生學科研實驗室提供。陜西省部分豬場血淸118份，可分為陜南地區58份、陜北地區30份、關中地區30份。-80 ℃保存。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計與合成 從GenBank上下載CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV的不同來源分離株全基因序列，通過DNAStar軟件對各種病毒的分離株序列進行比對分析，選擇不同病毒保守的基因序列。以篩選的病毒保守序列為模板，用Primer5軟件分別設計了這5種病毒的特異性引物。引物由華大基因科技服務有限公司合成。引物信息見表1。

1.3.2 病毒核酸提取和cDNA合成 按照TIANGEN公司DNA提取試劑盒說明書操作，分別提取PCV2、PRV和PPV等3種病毒細胞培養物的總DNA。用TRIZol法分別提取CSFV和PRRSV細胞培養物中的總RNA，用Thermo Fisher Scientific反轉錄試劑盒對所提取的RNA進行反轉錄，合成cDNA。

表1 所用引物序列

1.3.3 CSFV和PRRSV雙重RT-PCR方法的建立

1.3.3.1 CSFV、PRRSV cDNA的PCR擴增 以合成的CSFV、PRRSV的cDNA為模板，分別建立擴增CSFV、PRRSV的PCR方法。PCR反應體系為20 μL：包括2×TaqMasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL(終濃度均為0.25 pmol/μL)，cDNA 1 μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。取10 μL PCR產物進行瓊脂糖電泳后觀察結果。將獲得的符合預期大小的條帶進行膠回收，與pMD19-T載體連接，陽性質粒送華大基因科技服務有限公司(北京)測序。

1.3.3.2 CSFV和PRRSV雙重PCR反應條件的篩選 首先確定最適的雙重PCR退火溫度，PCR反應體系為20 μL：包括2×TaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 5 μL，CSFV和PRRSV上、下游引物各1 μL(終濃度0.25 pmol/μL)，cDNA 1 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；退火溫度分別設定為54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃，45 s；72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。取10 μL PCR產物進行瓊脂糖電泳，觀察結果。

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在確定雙重PCR最適退火溫度的基礎上，對引物最適終濃度進行篩選。反應體系及條件同前，將每條引物的終濃度分別調整為0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL，進行PCR擴增，篩選出最適引物使用量。

1.3.3.3 雙重PCR的特異性和敏感性 分別以CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA，PRV、PCV2、PPV的DNA為模板，按照確定的CSFV和PRRSV雙重PCR條件進行擴增，以檢測方法的特異性。

調整兩種病毒cDNA含量相同后取等體積混合，依次進行10倍倍比稀釋，以建立的CSFV和PRRSV雙重PCR條件進行擴增，評價方法的敏感性。

1.3.4 PCV2、PRV和PPV三重PCR方法的建立

1.3.4.1 PCV2、PRV和PPV單重PCR檢測 PCR反應體系為20 μL：包括2×TaqMaster Mix 10 μL，RNase-free ddH2O 6 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。取10 μL PCR產物進行瓊脂糖電泳，觀察結果。

1.3.4.2 PCR擴增產物的鑒定 將獲得的符合預期大小的條帶進行膠回收，按1.2.3.1的方法進行回收產物的測序鑒定。

1.3.4.3 三重PCR擴增體系的建立 分別以每種病毒的DNA、三種病毒組合的DNA為模板，通過對反應條件的優化，將3對引物以0.25 pmol/μL的終濃度混合加入20 μL PCR反應體系中，分別以54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃的退火溫度，保持其他條件不變進行PCR擴增，篩選出最佳退火溫度。在另一PCR反應體系(20 μL)中，將3對引物終濃度分別設定為0.2 pmol/μL、0.25 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL，并按照確定的最佳退火溫度，保持其他試劑及反應條件不變進行PCR擴增，篩選出最佳引物濃度。

1.3.4.4 三重PCR反應的特異性和敏感性 分別以PCV2、PRV、PPV的DNA，PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV的cDNA為模板，按照確定的最佳三重PCR反應條件進行PCR擴增，評價方法的特異性。

調整3種病毒cDNA含量相同后取等體積混合，依次進行10倍倍比稀釋，以建立的PCV2、PRV和PPV三重PCR進行擴增，評價方法的敏感性。

1.3.5 臨床樣品的檢測 用建立的雙重PCR和三重PCR方法分別對采集的118份豬血清樣品進行CSFV、PRRSV及PCV2、PRV和PPV的檢測。

2 結果

2.1 不同病毒單重PCR檢測方法的建立 分別用設計的CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV特異性引物、模板，建立了分別檢測這5種病毒的RT-PCR和PCR方法。在CSFV中可以擴增出大小約438 bp的目的條帶，在PRRSV中擴增出大小約535 bp的目的條帶，見圖1。在PCV2、PRV和PPV中分別擴增出大小約880 bp、213 bp和295 bp的目的條帶，見圖2。將擴增產物純化后測序，結果顯示,均為特異性的條帶(測序結果未顯示)。

圖1 CSFV和PRRSV的PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:PRRSV；2:CSFV；3-4:陰性對照

圖2 PCV2、PRV和PPV的單重PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:PCV2；2:PRV；3:PPV；4-6:陰性對照

2.2 CSFV和PRRSV雙重PCR的最佳條件 通過對雙重PCR不同退火溫度下條帶的觀察，確定CSFV和PRRSV雙重PCR最適退火溫度為62 ℃(圖3)。引物的終濃度為0.4～0.5 pmol/μL時，PCR產物量最大且基本一致，故選擇引物的終濃度為0.4 pmol/μL(圖4)。

圖3 退火溫度優化的雙重RT-PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:54 ℃；2:56 ℃；3:58 ℃；4:60 ℃；5:62 ℃；6:陰性對照

2.3 CSFV和PRRSV雙重PCR的特異性和敏感性 用建立的雙重PCR方法分別檢測CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV2、PPV。結果顯示，從CSFV和PRRSV中擴增出與預期大小一致的目的條帶，其余病毒未擴增出產物(圖5)。雙重PCR的敏感性結果顯示，CSFV的cDNA最低檢測量為7.5 pg/μL，PRRSV為14.2 pg/μL(圖6)。

圖4 引物濃度優化的雙重RT-PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:陰性對照；2:0.2 pmol/μL；3:0.3 pmol/μL；4:0.4 pmol/μL；5:0.5 pmol/μL

圖5 特異性擴增的雙重PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:CSFV和PRRSV基因雙重RT-PCR擴增；2:PRV；3:PCV2；4:PPV；5:PEDV；6:TGEV；7:陰性對照

圖6 敏感性擴增雙重的PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1-6:模板稀釋度分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；7:陰性對照

2.4 PCV2、PRV和PPV三重PCR的建立 在退火溫度為56℃，PCV2和PRV的引物終濃度為0.2 pmol/μL，PPV的引物終濃度0. 3 pmol/μL時進行三重PCR擴增，可獲得PCV2、PRV和PPV清晰的3條特異性條帶，大小分別為880 bp、213 bp、295 bp，見圖7。

圖7 PCV2、PRV和PPV的三重PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:三重PCR擴增；2:PCV2的PCR擴增；3:PPV的PCR擴增；4:PRV的PCR擴增 ; 5:陰性對照

2.5 檢測PCV2、PRV和PPV三重PCR的特異性和敏感性 用建立的三重PCR方法分別檢測CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV2、PPV。結果顯示，僅從PCV2、PRV、PPV的模板中擴增出與預期目的條帶大小一致的產物，從其他病毒中均未擴增出產物(圖8)。

圖8 特異性擴增的三重PCR電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:PCV2、PRV和PPV基因三重PCR擴增；2:CSFV；3:PRRSV；4:PEDV；5:TGEV；6:陰性對照

敏感性結果顯示，建立的三重PCR方法對PCV2的DNA最低檢測量為6.9 pg/μL，PRV的最低檢測量為9.2 pg/μL，PPV的最低檢測量為8.6 pg/μL(圖9)。

圖9 敏感性擴增的三重PCR電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1-4:模板稀釋度分別為10-3、10-2、10-1、100；5:陰性對照

2.6 臨床樣品的檢測 用建立的雙重RT-PCR和三重PCR方法分別對豬血清樣品進行病毒檢測。其中從陜南豬場58份樣品中5種病毒的檢出率分別是，CSFV為5.17%(3/58)，PRRSV為29.31%(17/58), PCV2 為10.34%(6/58), PRV為20.69%(12/58),PPV 為0%(0/58)；從陜北豬場30份樣品中5種病毒的檢出率分別是CSFV 為3.33%(1/30)，PRRSV 為3.33%(1/30)，PCV2為 26.67%(8/30), PRV 為36.67%(11/30)，PPV 為0%(0/30)；從關中豬場30份樣品中5種病毒的檢出率分別是, CSFV為3.33%(1/30)， PRRSV 為26.37%(8/30)， PCV2 為13.33%(4/30)， PRV為 13.33%(4/30)，PPV為0%(0/30)，部分樣品檢測電泳圖見圖10和圖11。臨床樣品檢測中PPV均為陰性，為了進一步驗證三重PCR方法的敏感性，對樣品再次進行了PPV的單重PCR。結果均未檢測到PPV，部分樣品PPV單重PCR見圖12。

圖10 部分臨床樣品CSFV和PRRSV雙重RT-PCR產物電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1-6:臨床樣品；7:陽性對照

圖11 部分臨床樣品PCV2、PRV和PPV三重PCR電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:陽性對照 ; 5-6:臨床樣品

3 討論

隨著我國養豬業的規模化程度的不斷提高，養殖密度的加大，也為疾病的傳播和發生創造了條件，給養豬業帶來了巨大的疫病風險。目前，豬場出現的傳染性疾病，由單一病原引起的較少，混合感染比較多見，使得臨床上的表現復雜化，給疾病診斷帶來了挑戰和困難。病原的早發現是制定有效防控措施、防止疾病發生的基礎，敏感、準確、快速、可操作性強的檢測方法是及早確定病原，采取有效措施的有效工具。

圖12 部分臨床樣品PPV檢測的單重PCR電泳圖

M:DNA標準DL-2 000；1:陰性對照；2:陽性對照；3-5:臨床樣品

病毒的檢測方法主要有病毒分離鑒定、免疫學技術、血清學技術、分子生物學技術等，這些技術檢測方法在特異性、敏感性以及時效性等方面都有各自的優缺點[10-14]。分子生物學技術主要是基于核酸擴增的PCR技術，目前已成為動物疫病檢測和診斷中最常用的方法，并由此衍生出多種基于PCR的技術，多重PCR技術可以同時檢測多種病原，在生產上得以廣泛應用[15]。本研究對當前養豬業危害較大的5種病毒為檢測目標，通過對各種病毒參考毒株序列的同源性分析，選擇其保守基因片斷設計引物，分別建立了檢測核酸類型為RNA病毒的多重RT-PCR檢測方法，核酸類型為DNA病毒的多重PCR檢測方法。經過對多重PCR體系、引物的使用濃度、反應條件、敏感性、特異性的不斷優化，分別建立了檢測CSFV和PRRSV的雙重RT-PCR，檢測PCV2、PRV和PPV的三重PCR方法。所建立的方法對CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV核酸的檢出量分別為7.5 pg/μL、14.2 pg/μL、6.9 pg/μL、9.2 pg/μL和8.6 pg/μL。為了檢驗方法的可用性，用所建立的方法對豬場送檢的118份豬血清進行了檢測，為了確保檢測的準確性，對獲得的各種病毒特異性PCR產物進行純化回收和序列測定，同時用待檢病毒特異性RT-PCR或PCR方法進行復檢，結果顯示，所建立方法的特異性良好，可以用于臨床檢測。在樣品檢測中，分別檢測到了CSFV、PRRSV、PCV2和PRV，但是未檢測到PPV。可以看到CSFV、PRRSV、PCV2和PRV在豬場的感染率還較高，并且形成了病毒血癥，需要引起高度關注，及時采取措施予以防控。在118份血清中未檢出PPV，但并能完全確定豬群中不存在PPV的污染情況，只是未形成毒血癥，所以對PPV的檢測還要結合臨床癥狀觀察，選擇組織樣品作為檢測材料進行病毒檢測。

在隨后的研究中我們還要對建立方法的臨床上進行大范圍應用，進一步優化，進行試劑盒的組裝，為這些病毒的檢測提供可應用的方法和產品。