H5亞型禽流感病毒熒光檢測試紙條的研制

孫 潔，陳 雨，吳 峰，王津津，陳 兵，鄭曉聰，陶 虹，劉建利，陳書琨，林慶燕，秦智鋒,

(1.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳518045；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東深圳518045；3.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連116023；4.清華大學深圳研究生院，廣東深圳518001)

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)為正粘病毒科甲型流感病毒屬，基因組為8條單股負鏈RNA，可編碼10個蛋白[1]。 禽流感危害大，變異強，是傳播性很強的傳染病和人獸共患病[2]。免疫層析技術(Immu-nochromatography assay，ICA)在ELISA技術、單克隆抗體技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的快速檢測技術，由于其操作簡便、耗時短而在檢測領域飛速發(fā)展[3-6]。用量子點替代傳統(tǒng)膠體金標記的免疫層析技術靈敏度高于膠體金標記的免疫層析技術10倍～100倍，目前，基于量子點標記技術的免疫層析技術已廣泛用于病原體、蛋白標志物、核酸等的檢測[7-8]。本研究應用熒光量子點來代替常規(guī)的酶標記物和膠體金作為標記材料，建立了H5亞型AIV熒光量子點免疫層析現(xiàn)場檢測方法(H5-AIV-QD-LFIA)，提高了檢測的靈敏度，特異性和重復性。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料 AIV H5(Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8)亞型、H7亞型、H7N9亞型、H9亞型、豬流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型血凝抑制試驗抗原、新城疫(NDV)抗原，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎(ILTV)、減蛋綜合征病毒76株(EDS-76)、510份泄殖腔/喉棉拭子樣品,均由深圳檢疫局動植中心保存；SP2/0-Ag14(簡稱SP2)骨髓瘤細胞，禽流感滅活疫苗(H5N2，D7株),購自華大基因科技服務有限公司；重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗(Re-6株+Re-4株)，購自廣東永順生物有限公司；禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗(Re-6株+Re-10株)，購自哈爾濱維科生物技術有限公司。A/Vietnam/1194/2004(H5N1)HA 蛋白(HA-1)、A/bar-headed goose/Qinghai/14/2008(H5N1)HA重組蛋白(HA-2)、A/American green-wingedteal/California/HKWF609/2007(H5N2) HA重組蛋白(HA-3)、A/duck/NY/191255-59/2002(H5N8)HA重組蛋白(HA-4)，購自北京義翹神州科技有限公司。AIV H5亞型檢測卡為韓國Anigen公司產品。

細胞培養(yǎng)基DMEM和1640、GIBCO胎牛血清，購自 ThermoFisher公司；PVDF 膜(0.2 μm/0.45 μm)，購自Milipore公司；NAbTIMSpin Kits for Antibody Purification、羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；水溶性羧基化熒光量子點，購自海王星辰藥業(yè)有限公司。

1.2 單克隆抗體(MAb)的制備 5次免疫，用蔗糖梯度離心純化的H5亞型病毒株免疫BALB/c小鼠，最后一次免疫使用HA-2經尾靜脈沖擊免疫。用HA-1對雜交瘤細胞陽性株的篩選，再用HA-2、HA-3、HA-4做3次亞克隆的篩選。篩選的陽性雜交瘤細胞株制備小鼠腹水單抗，純化備用。

1.3 H5-AIV-QD-LFIA試紙條的研制 量子點用0.1 mol/L MES洗滌離心重懸后加入5 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS反應30 min，離心洗滌3次，用0.05 mol/L硼酸溶液重懸。加入0.08 mg 單抗到 1 mg活化量子點中，37 ℃反應3 h，5% BSA封閉，37 ℃，30 min。反應完后離心3次并用0.02 mol/L PBS溶液重懸，4 ℃保存。

將羊抗鼠IgG用PBS緩沖液配制為0.5 mg/mL濃度，將包被抗體用PBS緩沖液配制為2 mg/mL濃度。將羊抗鼠IgG噴涂在質控線位置，將包被抗體噴涂在檢測線位置，37 ℃干燥4 h。玻璃纖維墊用含D-(+)海藻糖，1%BSA和0.1%Tween20的磷酸鹽緩沖液浸泡，37 ℃干燥3 h。量子點標記捕捉抗體探針按10 μL/cm量噴涂在樣品墊上，37 ℃干燥3 h，切成3.5 mm寬。

樣品中存在H5亞型AIV時，H5-AIV與量子點標記的單抗結合后，在檢測線位置聚集。未被捕獲的量子點標記抗體被包被的羊抗鼠IgG捕獲，在質控線位置聚集。質控線和檢測線捕獲的量子點在365 nm紫外光照射下會發(fā)出明亮的紅色熒光條帶，檢測原理見中插彩版圖1。

1.4 H5-AIV-QD-LFIA試劑條的評估試驗

1.4.1 特異性試驗 檢測H5亞型AIV血凝抑制試驗抗原(Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7和Re-8)，禽流感滅活疫苗(H5N2，D7株)、重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗(Re-6株+Re-4株和Re-6株+Re-10株)，其他亞型流感病毒血凝抑制試驗抗原(H7亞型、H7N9、H9亞型、H1N1、H3N2)和其他病毒(NDV、IBV、ILTV、EDS-76)。

1.4.2 敏感性試驗 用PBS緩沖液倍比稀釋AIV H5(Re-6)亞HI抗原，濃度為0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL，用H5-AIV-QD-LFIA和AIV H5亞型膠體金檢測卡進行檢測。

1.4.3 重復性試驗 將純化的AIV H5(Re-6)亞型血凝抑制試驗抗原稀釋成100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL，作為重復性試驗待檢抗原，重復10次。

1.4.4 臨床樣品的檢測 檢測雞場和候鳥采集的510份泄殖腔/喉棉拭子，同時按國標《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》(GB/T 19438.2-2004)進行比對檢測。

2 結果

2.1 獲得4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株 4株單克隆抗體雜交瘤細胞株H5HA9#、H5HA18#、H5HA21#和H5HA25#，對4種H5亞型的HA表達蛋白均呈現(xiàn)陽性ELISA反應結果，單抗?jié)舛群虴LISA效價見表1。

表1 4株單克隆抗體濃度與效價

將4種純化的單抗純化后兩兩配對，分別作為捕捉抗體標記量子點，包被抗體噴涂于T線上，檢測H5亞型AIV滅活疫苗Re-6+Re-4和Re-6株+Re-10株的破乳疫苗，剔除假陽性和假陰性的結果，篩選H5HA25#作為捕捉抗體來標記熒光量子點，H5HA18#作為包被抗體來制備H5-AIV-QD-LFIA試劑條。

2.2 H5-AIV-QD-LFIA試劑條特異性試驗結果 9株H5亞型標準抗原和疫苗均為陽性結果，而5株非H5亞型流感病毒和4株家禽呼吸道病毒均為陰性結果(見中插彩版圖2)。

2.3 H5-AIV-QD-LFIA試劑條敏感試驗結果 H5-AIV-QD-LFIA試紙條檢測AIV H5(Re-6)亞型血凝抑制試驗抗原的靈敏度為1 ng/mL，高出AIV H5亞型抗原膠體金檢測卡靈敏度100倍(見中插彩版圖3)。

2.4 H5-AIV-QD-LFIA重復性試驗結果 各組試劑條顯色均勻，經免疫層析檢測儀檢測的熒光強度值的組內和組間重復性試驗的變異系數CV值均小于10%(見中插彩版圖4)，重復性較好。

2.5 H5-AIV-QD-LFIA臨床樣品檢測結果 結果顯示，熒光檢測試紙條檢測方法的符合率達到99.8%，膠體金檢測方法的符合率為98.4%(表2)。

表2 符合性檢測試驗結果

3 討論

H5亞型AIV為高致病性禽流感，一旦發(fā)生，必須進行申報。在禽流感防控中，快速準確檢測是防控禽流感發(fā)生和流行的前提和基礎。禽流感的監(jiān)測方法包括傳統(tǒng)方法與分子生物學方法。傳統(tǒng)方法主要有病毒分離培養(yǎng)鑒定和血清學診斷，不足之處在于操作繁瑣、耗時和結果重復性不好，而分子生物學方法，如RT-PCR與基因芯片技術具有特異、敏感、簡便等特點[9-11]，但對實驗條件要求高，對人員的操作技能水平也有要求。1990年Beggs M等[12]人使用膠體金作為標記材料檢測人絨毛膜促性腺激素后，免疫層析技術被廣泛用于檢測激素、病原體、疾病標志物、農藥/獸藥殘留等。膠體金標記可以肉眼判斷結果，只需要幾分鐘。2007年，Liu等[13]建立了采用Qdot655量子點替代膠體金標記檢測前列腺特異性抗原(PSA)，檢測靈敏度可到20 pg/mL。用超敏熒光材料標記物替代酶聯(lián)免疫吸附試驗(Dot-ELISA)和免疫酶層析試驗(EICA)的酶標記物，不需要酶促反應底物，縮短了反應時間[14-15]，逐漸成為快速檢測領域研究的新趨勢。

本研究采用H5亞型不同毒株的HA重組表達蛋白進行免疫，提高了針對保守HA抗原決定簇的抗體雜交瘤細胞的產生。同時在篩選雜交瘤細胞株時，采用了H5亞型不同毒株的表達重組蛋白來進行雜交瘤細胞株的篩選，確保篩選出的雜交瘤細胞株分泌的單抗能夠同時與不同N亞型的H5病毒反應，以最大限度地保證篩選出單抗的廣譜性。經過4次亞克隆，最終篩選出4株雜交瘤細胞株。經過單克隆抗體的兩兩配對，找到了可以在免疫層析試紙條中進行夾心配對的2株單抗。本文建立的H5-AIV-QD-LFIA能夠特異檢測禽流感H5亞型病毒，檢測靈敏度較膠體金方法高100倍，達到1 ng/mL，但其靈敏度不及實時熒光RT-PCR。本研究中所建立的H5-AIV-QD-LFIA對9種AIV H5亞型均可以檢出，對5種其他亞型的流感病毒和其他家禽呼吸道病毒無交叉反應，特異性強；對臨床樣本檢測符合率較高，可適用于AIV H5亞型的快速檢測。