雞滑液囊支原體的流行調查及不同地區分離株藥物敏感性分析

招麗嬋，覃健萍，王占新，林 欣，孫石開，魯俊鵬

(廣東溫氏食品集團股份有限公司，廣東云浮527400)

雞滑液囊支原體病是由雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)引起的一種傳染病，又稱雞傳染性滑膜炎(Avian onfectious synovitis)，其特征是關節腫大、滑液囊及肌腱發炎和實質器官的腫大，一旦在雞群中感染很難根除[1]。該病能夠感染雞和火雞，不同菌株的致病力有所不同，在雞群中長期存在，會導致飼料利用率低、生長發育遲緩、種雞生產性能下降[2]。感染發病雞群抵抗力下降，易與其他病原體混合感染，加劇病情，增加死亡率，造成嚴重的經濟損失。本病一年四季均可發生，但以冬春季節易發，各種日齡雞只均易感， MS除了水平傳播外，還可以發生垂直傳播，通過感染雞或火雞經蛋傳播給子代，感染初期經卵傳播率較高[3]。該病先后在加拿大、英國、挪威、德國、法國、南非等國相繼報道，世界性分布[4-5]，給養殖業帶來較大的經濟損失。防控雞滑液囊支原體病主要通過疫苗免疫和藥物控制兩種方法[6-7]。我國養殖場主要靠抗菌藥物預防及治療該病，但隨著藥物的廣泛使用，其防治效果欠佳，菌株耐藥性加劇越來越明顯。本研究主要對近年來雞滑液囊支原體病的流行病學進行了調查分析，開展不同地區雞滑液囊支原體臨床菌株常規抗菌藥物敏感性分析，為雞滑液囊支原體病臨床合理用藥提供指導。

1 材料

1.1 雞滑液囊支原體菌株及臨床病料的采集 2015-2017年分別從廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等地方未免疫MS 活疫苗養殖場送檢的157份疑似雞滑液囊支原體感染的病雞中，無菌采集其腫脹跗關節腔內容物用于臨床流行菌株分離鑒定。MS-H株為澳大利亞生物資源公司雞滑液囊支原體活疫苗株。

1.2 培養基改良Frey氏液體培養基，購自美國BD公司。

1.3 主要試劑 MS陽性血清(批號：200501)、MG陽性血清(批號：200701)和標準陰性血清(批號：20071217)，購自中國獸醫藥品監察所；Taq酶，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 抗菌藥物 鹽酸環丙沙星可溶性粉(批號：20170302)；鹽酸多西環素可溶性粉(多西欣，批號：20170616)；鹽酸沙拉沙星可溶性粉(沙拉欣，批號：20170805)；鹽酸金霉素可溶性粉(批號20161217)；鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素(利高欣，批號：20170703)；替米考星可溶性粉(替美康，批號：20170407)；酒石酸泰萬菌素可溶性粉(愛樂新，批號：20170702)；酒石酸泰樂菌素可溶性粉(泰樂欣，批號：20170217)；硫酸慶大霉素可溶性粉(力速智，批號：20170407)，以上藥物購自廣東溫氏大華農生物科技有限公司動物保健品廠；泰妙菌素(批號：B433719)，禮來(上海)動物保健有限公司。

2 方法

2.1 臨床現場調查 2015年1月-2017年12月期間，本試驗人員分別對廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等地10個不同地區養殖場的MS感染情況進行現場調查，系統開展了對各個養殖場不同品種雞的感染情況(包括發病日齡、品種、發病季節等)及臨床癥狀進行統計分析，并對部分發病雞進行剖檢觀察。

2.2 病原學調查

2.2.1 病料來源 分別從廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等地10個不同地區未免疫MS活疫苗且有典型滑液囊支原體病癥狀的肉雞養殖場，無菌采集腫脹跗關節、腫脹足掌部及龍骨滑液囊囊腫的發病雞關節積液、黃色干酪樣病變組織。

表1 2015-2017年病料來源信息

2.2.2 病原分離與鑒定 無菌采集腫脹跗關節、足掌內容物及龍骨滑液囊囊腫內容物，接種于改良Frey氏液體培養基，置37 ℃，150 r/min振蕩培養。當改良Frey氏液體培養基的顏色由猩紅變成橘黃時，傳代接種到新的改良Frey氏液體培養基中，并取液體培養物涂片，進行姬姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態，同時將液體培養物接種雞滑液囊支原體固體培養基培養，置低倍鏡下觀察菌落形態。

2.2.3 分子生物學鑒定 取分離獲得的疑似MS流行菌株，根據GenBank中收錄的MSVlhA基因序列設計引物，進行PCR及序列測定以確診發病雞為MS感染。根據雞滑液囊支原體VlhA基因設計合成引物，預期擴增片段大小為300 bp，上游引物 MSF：5′-TAAAAGCGGTTGTGTATCGC-3′,下游引物MSR:5′-CGCAGGTTTGCACGTCCTTCATCG-3′。

2.3 血清學試驗 液體培養物37 ℃培養3代后，參照姜平[8]介紹的方法，離心濃縮進行平板凝集試驗。

2.4 抗菌藥物稀釋 分別稱取氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類、林可胺類、四環素類及截短側耳素類藥物，溶于適宜稀釋液中，無菌操作配制成濃度為各藥物推薦使用濃度的8倍量進行敏感性試驗，監測不同地區流行株對不同類型抗生素的藥物敏感性。

2.5 不同地區臨床分離株最低抑菌濃度(MIC)的測定 分別從廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等地10個不同地區分離鑒定的96個MS流行株中，隨機選取10株生長優勢流行株進行MIC測定，參照Hannan推薦的方法等并進行改進。根據不同分離株的顏色變化單位(CCU)決定接種菌液量為106CCU/mL。按照各藥物推薦使用濃度的8倍量進行稀釋，在96孔細胞微孔板中采用二倍稀釋法進行最小抑菌濃度測定。判定標準為陰性對照孔不變色，陽性對照孔變為黃色，以試驗孔不發生顏色變化(即沒有MS生長)的最小抗生素濃度孔的稀釋度為該藥物對被試菌株的MIC。

3 結果

3.1 發病情況 調查結果表明，雞群MS自然感染多見于l～4月齡，平均感染日齡為60日齡，而2017年早期20～40日齡其感染數量較2015年及2016年均有較大幅度下降。總體看來，40～80日齡時期是該病的防控關鍵期，在此期間需提前做好預防。來自不同地區的8個不同品種雞(矮腳黃、清遠麻、文昌雞、黃油雞、天露黑及817肉雜雞)的平均感染率為8.89%，平均死亡率為2.79%，817肉雜雞及清遠麻雞的感染死亡率占居首位。此外，不同地區的感染情況統計顯示，廣東新興、廣西南寧、江蘇鹽城的病死率較高，尤其以清遠麻、矮腳黃及817肉雜雞品種多發，且用藥難以控制。2015-2017年不同月份感染情況調查表明，該病一年四季均有發生，南方地區一般在2～6月春夏交接梅雨季節期間及冬春季節多發易發。推測可能與該時期潮濕墊料容易滋生細菌，或南方地區高溫高濕氣候有關。期間多見與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌腸炎、球蟲病等混合感染。

3.2 臨床癥狀 對MS感染雞只的臨床癥狀統計表明：雞群發病初期，采食量輕度減少，精神輕度不振，不易察覺。隨著發病時間的延長，出現典型癥狀，采食明顯減少，病雞出現進行性消瘦，行走緩慢，閉眼呆立，拉綠色稀便，少數個別病雞有甩鼻等呼吸道癥狀；跗關節和趾關節腫脹，腫脹處有波動感、熱感；行走困難，足掌部及胸部龍骨處有囊腫或腫脹突出。發病后期，雞體極度消瘦，呈現營養不良狀態。

3.3 剖檢病變 發病初期無明顯病變；發病中期，病雞的足掌部、跗關節腫脹部位剖開后有少量白色或淡黃色透明滲出性液體；隨著病情發展，分泌物增多并變渾濁，呈灰白色膿性黏液或黃白色纖維素性干酪樣物質，發病中后期個別發病雞龍骨滑液囊部位也出現黃白色干酪樣物質。

3.4 血清學試驗 液體培養物37 ℃培養3代后離心濃縮，平板凝集試驗結果顯示，分離菌能夠與MS標準陽性血清呈凝集反應，而與MG標準陽性血清不產生凝集反應。

3.5 病原學診斷結果

3.5.1 病原分離 采集157份來自不同地區具有典型滑液囊支原體臨床癥狀病死雞的跗關節、足掌及龍骨滑液囊囊腫病料進行細菌分離，對分離所得疑似菌株進行姬姆薩染色鑒定。通過多形態菌體形態和煎蛋樣菌落初步診斷，分離到疑似MS流行菌株共計96株，分離率為61.15%。各地區MS分離株數及命名情況見表2。

表2 2015-2017年 5省份雞群滑液囊支原體分離情況

3.5.2 分子生物學鑒定 將96株疑似MS分離流行菌株進行了VlhA基因PCR擴增，PCR結果表明：本試驗分離獲得的MS疑似流行株均能擴增出約300 bp的特異性片段，與引物設計的預期結果一致。進一步對雞滑液囊支原體VlhA基因PCR擴增片段進行測序，并將測序結果與GenBank數據庫中的MSVlhA序列比對，同源性為98.75%，確診96株分離株均為MS菌株。

3.6 不同地區臨床分離株最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用二倍稀釋法測定了泰樂菌素等10種抗生素對雞滑液囊支原體活疫苗株(MS-H)及雞滑液囊支原體臨床分離株的MIC測定(見表3)。結果顯示，10株臨床分離株均對截短側耳素類泰妙菌素、大環內酯類泰萬菌素、泰樂菌素及四環素類多西環素比較敏感；林可胺類鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素、大環內酯類替米考星等敏感性次之；四環素類金霉素、氨基糖苷類慶大霉素敏感性顯著下降；喹諾酮類鹽酸環丙沙星、沙拉沙星敏感性較差。MS-H活疫苗株對截短側耳素類泰妙菌素、大環內酯類泰萬菌素、泰樂菌素、林可胺類鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素、四環素類金霉素、多西環素、氨基糖苷類慶大霉素則均較為敏感。不同地區不同品種雞只分離株對個別同種類抗生素敏感性差異較大，尤其表現在大環內酯類替米考星、林可胺類鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素及四環素類金霉素，其中不同菌株對金霉素的敏感性在3.91 mg/L～1 000 mg/L不等。

表3 慶大霉素等10種抗生素對雞滑液囊支原體的MIC值 (mg/L)

4 討論

本研究對我國廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等5個省份10個不同地區的養殖場調查發現，MS感染多見于1～4月齡，40～80日齡是MS野毒自然感染的敏感高峰期，感染率為5.89%～14.23%不等，矮腳黃、清遠麻、817肉雜雞等8個不同品種雞病死率差異較大，清遠麻、天露黑及817肉雜雞平均感染率為10.98%；平均死亡率為3.01%。矮腳黃、土雞、文昌雞等感染死亡率較低。可見，MS田間流行株對不同品種雞的感染敏感性差異較大，或者與個別品種飼養過程中選育生長加快有一定關系。從不同地區的感染情況統計來看，廣東新興、江蘇鹽城、廣西南寧等地區的感染率比較高。這可能與該地區的養殖密度大，雞群健康度比較復雜有關。對2015-2017年不同月份雞只感染情況調查的結果表明，該病一年四季均有發生，南方春夏潮濕天氣、北方冬春季節易發，總體發病2015年最為嚴重，2016年及2017年逐年減少。

MS感染有水平傳播和垂直傳播兩種方式，本研究通過對多個種雞養殖場的追蹤調查發現，部分小于20日齡的商品肉雞發病，進一步追溯可能由于該批次種蛋的種雞群當時已出現MS感染導致垂直傳播而引起的。40～80日齡感染的雞只，大多數是由于養殖場飼養環境，飼養管理欠佳，通過水平傳播方式感染發病，此時MS流行株非常容易通過呼吸道感染進入雞只體內，侵入雞跗關節和足掌部關節等，致使受侵害關節腫脹發炎，從而導致臨床上明顯的關節炎癥狀。主要表現為青年雞趾關節腫脹、足掌部、跗關節腫脹、龍骨滑液囊囊腫，種雞的生產性能下降，料肉比增加，種蛋多見“太陽蛋”，入孵率下降等癥狀。

2015-2017年分別從10個不同地區的養殖場157份疑似支原體感染病例進行病原菌的分離鑒定，形態病原學結合PCR擴增測序確認分離獲得雞滑液囊支原體流行株共計96株。雖然支原體的分離鑒定工作難度較大，耗時較長，但結果可靠準確，且能進一步進行藥敏試驗，對臨床用藥具有一定的指導意義。

從不同地區臨床分離株最低抑菌濃度測定結果看，慶大菌素等10種抗生素中，雞滑液囊支原體弱毒活疫苗株對大環內酯類泰樂菌素、泰萬菌素、替米考星、喹諾酮類環丙沙星、林可胺類鹽酸大觀林可霉素、四環素類金霉素及截短側耳素類泰妙菌素均高度敏感，因此在使用MS活疫苗進行雞滑液囊支原體防控期間需注意敏感藥物的停止使用。

10株雞滑液囊支原體臨床分離菌株對大環內酯類泰萬菌素、截短側耳素類泰妙菌素的MIC值分別為0.15 mg/L和0.24～0.96mg/L，不同地區分離株間測定的MIC值差異不大，說明泰萬菌素、泰妙菌素仍能保持較好的敏感性，該結果與Landman[7]等體外研究發現17種MS荷蘭本地分離株均對泰萬菌素、泰妙菌素敏感的結果一致，分析可能是因為泰萬菌素和泰妙菌素價格較貴，成本高，臨床使用不多，因此沒有造成雞滑液囊支原體對其產生耐藥性。宋戰勝[3]、曹中贊[10]等認為不同菌株對藥物的敏感性存在差異，本研究中廣東新興株和廣西玉林株對大環內酯類替米考星的最低抑菌濃度分別為750 mg/L和375 mg/L，而活疫苗MS-H株及其中3株雞滑液囊支原體臨床分離株的最低抑菌濃度則為5.86 mg/L，因此本試驗也證實了這一觀點。另外，值得關注的是江蘇鹽城株對四環素類金霉素的最低抑菌濃度為1 000 mg/L，與活疫苗MS-H株及臨床分離的廣東新興株相比其敏感性分別降低了256倍和128倍，可見在種肉雞飼養過程中長期的藥物防控和選育壓力下，個別地區已經出現了超級耐藥菌株。因此，在實際臨床生產中應定期對不同地區流行株進行藥敏試驗，選用有效的抗菌藥物，避免盲目的長期使用單一種類抗生素進行預防及治療，以減少菌株耐藥性的產生和擴散。