高通量測(cè)序研究早期斷奶仔豬糞便菌群的結(jié)構(gòu)性差異

崔 君，劉志鵬，殷 茵，李留安，金天明，柳巨雄

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津西青300384；3.天津市濱海新區(qū)畜牧服務(wù)中心，天津?yàn)I海300452；4. 天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津北辰300402)

仔豬早期斷奶和更換飼料是現(xiàn)代集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中提高母豬生產(chǎn)性能的重要手段之一，國(guó)內(nèi)大多采用21～28日齡斷奶。但早期斷奶仔豬消化系統(tǒng)和免疫器官發(fā)育不完善，仔豬斷奶后往往出現(xiàn)食欲差、消化不良、生長(zhǎng)遲滯、飼料利用率低等所謂“仔豬早期斷奶綜合征”。本研究結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐將21日齡斷奶仔豬的作為主要研究對(duì)象，將斷奶仔豬的糞便作為主要出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行差異性分析，意指出正常與異常的差異性，為生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 OMEAGE D4015糞便DNA提取試劑盒，TIANGEN DP209普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)，GENERAY 即用型Taq酶PCR試劑盒，GoldView Ⅰ型核酸染色劑，DNA Marker DL-2501，瓊脂糖， TAE緩沖液，糞便 DNA 提取試劑盒，Stool DNA Kit(Omega Biotek公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 從天津規(guī)模較大的養(yǎng)豬廠選取，均為自繁自養(yǎng)，品系為長(zhǎng)大，母豬存欄量在200頭以上，年出欄成品豬在2 000頭以上，基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平參考張建斌等[1]。采集6欄仔豬糞便，其中編號(hào)為A、B、C、D、E、F，分別按照用Z(正常)和Y(異常)表示[2]。

1.3 樣品的采集

1.3.1 血液樣品 用采血器采集仔豬前腔靜脈血液5 mL，室溫靜置1 h，以5 000 r/min離心10 min，取上清分裝備用。

1.3.2 糞便樣品 采集21日齡斷奶仔豬斷奶第4天(即25日齡)[3-4]的新鮮且未被污染的糞便，每欄至少釆集3頭，每個(gè)處理至少保存3份樣品。糞便采集時(shí)間盡量選擇在仔豬排泄高峰期，仔豬排泄時(shí)，用無(wú)菌采樣器及時(shí)接住，用無(wú)菌牙簽去掉前端約1～2 cm，采集5 g左右，用無(wú)菌取樣袋封存，立刻置于冰盒中，迅速凍存。對(duì)于未及時(shí)處理而遺落在地上的糞便，判為已被污染，不予收集。糞便采集結(jié)束后，及時(shí)安置入-80 ℃超低溫冰箱中保存并最好在1個(gè)月內(nèi)提取DNA[5]。正常糞便編號(hào)為AZ、BZ、CZ、DZ、EZ、FZ，異常編號(hào)為AY、BY、EY、FY(由于C、D 兩欄在取樣過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)異常糞便因此沒(méi)有采樣)，共計(jì)30個(gè)樣本。

1.4 方法

1.4.1 生化指標(biāo)測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀(GLAMOUR3000，美國(guó)MD儀器公司)測(cè)定。

斷奶仔豬糞便菌群基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增:使用DNA 試劑盒 (美國(guó) OMEGA公司)提取仔豬糞便的基因組 DNA，步驟參照說(shuō)明書。提取的DNA利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，DNA凝膠提取試劑盒提純。

1.4.2 高通量測(cè)序 使用Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen,Carlsbad,CA) 檢測(cè)DNA樣品的濃度，使用MetaVxTM文庫(kù)構(gòu)建試劑盒 (GENEWIZ, Inc.,South Plainfield,NJ,USA)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著水平P采用0.05，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 正常組與異常組基本生理指標(biāo)比較 研究發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬在經(jīng)受斷奶的應(yīng)激的刺激后，其體溫、心率和呼吸等基本生理指標(biāo)有了明顯的變化[6]，體溫的變化是免疫調(diào)節(jié)的外在表現(xiàn)，本研究中異常組的體溫變化與正常組相比達(dá)到差異顯著的程度(P<0.01)(表1)，究其原因可能是免疫應(yīng)激會(huì)誘發(fā)一系列機(jī)體代償性的抗應(yīng)激生理反應(yīng)，使代謝耗能有所增加造成的。

表1 斷奶仔豬生理生化指標(biāo)

*:P<0.05,差異顯著; **:P<0.01,差異極顯著

在常規(guī)的生化指標(biāo)中，糞便異常的仔豬AST、ALT、TP、ALP、GGT、UREA、CRE、GLU、CK、AMY、CA的測(cè)量值與正常仔豬的測(cè)量值比較均差異極顯著(P<0.01)，TBA的測(cè)量值差異顯著(P<0.05)，ALB、CHO、LDH測(cè)量值差異不顯著(P>0.05)。

2.2 正常組與異常組生物學(xué)分析比較

2.2.1 OUT聚類分析 要了解一個(gè)樣本測(cè)序結(jié)果中的菌種、屬等數(shù)目信息，就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作。OTUs是按照一致性和相似性聚類的Tags集合體。通常在97%相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行OTUs劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.2 物種注釋及分類結(jié)果統(tǒng)計(jì) 根據(jù)RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對(duì)OTUs的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。選定不同水平上樣品物種表達(dá)豐度形成物種分布柱狀圖，以便可以直觀的表示出各水平上的優(yōu)勢(shì)物種。

由中插彩版圖1可以看出在門水平的所有組別中，細(xì)菌組成90%以上主要集中在Firmicutes(厚壁菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)，但比例有所不同，這與此前報(bào)道相一致。正常組中Firmicutes占57.25%，Bacteroidetes占34.01%；異常組中Firmicutes所占比例更高為63.23%，而Bacteroidetes比例稍有降低，達(dá)到25.92%。

進(jìn)一步研究樣品，從綱水平的物種的聚類分析分布熱圖(見(jiàn)中插彩版圖2)來(lái)看，正常組中Clostridia(梭菌綱)的相對(duì)值最高，達(dá)到42%，Bacteroidia(擬桿菌綱)和Bacilli(芽孢桿菌綱)占比33%和11%，分列二、三；雖然在異常組中占據(jù)前列的同樣是這3個(gè)物種，但所占比例發(fā)生了變化，Bacilli沖在前列為30%，Clostridia和Bacteroidia均占比26%緊隨其后。

2.3 樣本復(fù)雜度分析

2.3.1 樣本多樣性分析 為了表達(dá)樣本所含物種的豐富程度和均勻度，我們可以用Rank-Abundance曲線來(lái)表示(見(jiàn)中插彩版圖3)，很顯然Z樣本的曲線更加平坦，表示物種組成更加豐富，而Y樣本曲線快速陡然下降，表明樣本中的優(yōu)勢(shì)菌群所占比例很高，多樣性較低。

2.3.2 物種Alpha多樣性分析 為了表達(dá)一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用Alpha多樣性來(lái)表示。通過(guò)ACE 、Chao1、Shannon以及Simpon等指數(shù)來(lái)描述樣品的豐富度和均勻分布情況來(lái)表達(dá)Alpha多樣性。

用SPSS17.0軟件對(duì)ACE、Chao1、Shannon以及Simpon等指數(shù)加以分析，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)在象征Alpha多樣性的參數(shù)中(OUTs分類為97%相似度水平)(表2)，ACE、Chao1、Simpson等用來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)多樣性的指數(shù)差異顯著(P<0.05)、Shannon指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。而Goods_coverage指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，正常和異常之間差異不顯著(P>0.05)，且所建立細(xì)菌文庫(kù)的覆蓋率均可達(dá)到99%以上，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所建立的文庫(kù)可比較真實(shí)有效地反映樣本環(huán)境細(xì)菌多樣性，具有研究意義和實(shí)用價(jià)值。

表2 Alpha多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3.3 物種Beta多樣性分析 Beta多樣性是生物多樣性的重要組成部分, 多用于不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，即利用各樣本序列間的進(jìn)化關(guān)系及豐度信息來(lái)計(jì)算樣本間距離，反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異的指標(biāo)。

熱圖中顏色深淺代表了樣本之間的相異程度，顏色越淺表示兩個(gè)樣本相異系數(shù)越小，物種多樣性的差異越小。從中插彩版圖4中可以看到Z組之間的顏色更淺，數(shù)值更接近于0，多樣性的差異相對(duì)較小，換句話說(shuō)Z組中菌群多樣性差異不大，相似性更高。而Y組樣品之間的菌群多樣性差異較大。

3 討論

本研究中斷奶仔豬的大部分的生化指標(biāo)均出現(xiàn)了差異顯著的變化，也就是說(shuō)在短短幾天中斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬造成的影響直接導(dǎo)致斷奶仔豬最基礎(chǔ)的生理指標(biāo)發(fā)生明顯變化，并在臨床表征中明顯體現(xiàn)。不過(guò)，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)中ALB、CHO、LDH在兩組數(shù)據(jù)中的變化并不明顯。主要是由白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)兩種成分構(gòu)成血清中的總蛋白(TP)，并且由肝臟合成而來(lái)。占總蛋白一半以上的白蛋白既可以作為緩沖劑，維持血容量，也可以作為某些物質(zhì)的運(yùn)輸載體，維護(hù)血液pH值穩(wěn)定[7]。而球蛋白則主要與機(jī)體免疫有關(guān)，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)在我們的試驗(yàn)中總蛋白的變化差異極顯著，可白蛋白的變化不顯著，這可能與應(yīng)激仔豬主動(dòng)發(fā)動(dòng)免疫，抗體水平升高有關(guān)[8]。血清總膽固醇(CHO)是由肝臟合成并儲(chǔ)藏其中，CHO的數(shù)值能反映肝臟和體內(nèi)脂肪代謝情況[9]，乳酸脫氫酶(LDH)是糖代謝過(guò)程中不可缺少的酶類[10]，斷奶仔豬無(wú)論正常組還是異常組總膽固醇均發(fā)生變化，但兩組中的差異并不明顯，說(shuō)明斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬造成的影響無(wú)論是否出現(xiàn)臨床癥狀，均會(huì)對(duì)機(jī)體脂肪代謝和糖代謝造成損傷。

有研究表明，在動(dòng)物不同年齡階段，不同的食物攝入會(huì)對(duì)腸道微生物的構(gòu)成有很大影響，特別是在斷奶期間[11-12]。腸道內(nèi)的核心菌群及其多樣性會(huì)直接影響腸道的消化吸收功能，并對(duì)其免疫功能的激發(fā)產(chǎn)生影響[13]。腸道中大量復(fù)雜的微生物菌群對(duì)動(dòng)物機(jī)體抵御外來(lái)微生物的入侵起著不可或缺的作用，并在長(zhǎng)期相互作用下使腸道獲得適應(yīng)性的免疫，也通過(guò)寄主產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子刺激自身免疫系統(tǒng)發(fā)力，進(jìn)而阻止腸炎的發(fā)生[14]。本研究中腸道的優(yōu)勢(shì)菌群為梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)，而正常組中梭菌占優(yōu)勢(shì)很可能由于有報(bào)道稱梭菌可以提高仔豬的免疫功能和抗氧化能力，增加腸絨毛高度、加深空腸和回腸的隱窩深度，從而改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能[15]，梭菌還在改善仔豬腸道環(huán)境，減少斷奶仔豬腹瀉方面有顯著的作用[16]。

腹瀉會(huì)造成腸道菌群失調(diào)，菌群數(shù)量和比例會(huì)發(fā)生復(fù)雜變化。與異常組相比，正常組的菌群多樣性會(huì)更豐富，并且每個(gè)樣品間的差異性并不大，這可能是仔豬腸道豐富的微生物菌群激發(fā)腸道的強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。對(duì)于仔豬來(lái)說(shuō)豐富的腸道菌群更能緩沖有害菌群對(duì)機(jī)體造成影響，從而不易表現(xiàn)出臨床癥狀，這與生化指標(biāo)的變化相一致。出現(xiàn)腹瀉后，腸道菌群的多樣性和占比會(huì)發(fā)生變化，個(gè)體樣本差異性大則與腹瀉造成的腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)有關(guān)[17]，這與本研究相一致。

天津地區(qū)斷奶仔豬糞便中，斷奶應(yīng)激會(huì)對(duì)斷奶仔豬造成一系列影響，變化包括生化指標(biāo)、糞便形態(tài)、腸道菌群多樣性等方面。

在斷奶持續(xù)過(guò)程中，出現(xiàn)臨床癥狀的仔豬生化指標(biāo)與未出現(xiàn)癥狀的仔豬相比，生化指標(biāo)會(huì)有顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬正常的生理狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生明顯的損傷，尤其是那些已經(jīng)出現(xiàn)腹瀉的仔豬。但從免疫功能建立、脂肪代謝和糖代謝的角度來(lái)看，無(wú)論斷奶仔豬是否出現(xiàn)臨床癥狀，仔豬體內(nèi)的相應(yīng)指標(biāo)均會(huì)發(fā)生變化，且并沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

在我們所采集的正常組和異常組的樣品中，可以看出兩組中出現(xiàn)了物種的交集。樣品從門水平上來(lái)說(shuō)，優(yōu)勢(shì)菌群主要集中在Firmicutes(厚壁菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)，但比例有所不同。從綱水平來(lái)分析，正常組中Clostridia(梭菌綱)的相對(duì)值最高，達(dá)到42%，Bacteroidia(擬桿菌綱)和Bacilli(芽孢桿菌綱)占比33%和11%，分列二、三；雖然在異常組中占據(jù)前列的同樣是這3個(gè)物種，但所占比例發(fā)生了變化，Bacilli沖在前列為30%，Clostridia和Bacteroidia均占比26%緊隨其后。

正常糞便的細(xì)菌菌群多樣性明顯高于異常糞便，但每個(gè)樣本之間的物種多樣性差異較小。這可能與腹瀉仔豬腸道內(nèi)某些微生物菌群的減少導(dǎo)致機(jī)體免疫和腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力減弱休戚相關(guān)。