miR-134通過介導CCND1表達下調抑制食管癌細胞增殖

李麗娜

(許昌學院醫學院,河南 許昌 461000)

食管鱗狀細胞癌(ESCC)在我國的發病率逐年升高〔1〕。ESCC患者早期多以胃部燒灼感和吞咽不適等非特異性表征為主，難以獲得早期診治。深入研究ESCC進展機制及診斷標志物對實現食管癌的二級預防具有重要意義。微小RNA(miRNA)是單鏈的長度較短的RNA，通常其堿基數量在22 bp左右〔2〕。miRNA的異常表達已在ESCC中被證實，其與細胞增殖、侵襲轉移〔3〕及血管新生〔4〕有關。miR-134已被查明在多種婦科腫瘤，包括子宮內膜癌〔5〕及乳腺癌〔6〕中的表達水平顯著下調。目前，miR-134在ESCC中的含量及生物功能尚不明確。本課題擬研究miR-134在ESCC中的表達水平；利用慢病毒感染特異性上調ESCC細胞中miR-134的表達水平，探究miR-134對ESCC細胞生物學功能的影響。

1 材料和方法

1.1臨床標本 選取2015年1月至2018年1月于許昌學院醫學院收治并行手術切除的60對ESCC組織及對應癌旁組織(距腫瘤邊緣距離>2 cm)標本，男34例，女26例，年齡(56±6)歲。

1.2細胞及實驗試劑 ESCC細胞TE-1于許昌學院醫學院細胞實驗室保存；慢病毒(miR-134及陰性對照)、引物(miR-134及U6)分別由廣州復能基因及廣州銳博生物科技有限公司提供；DMEM、胎牛血清、Trizol、RT-PCR試劑盒、DyNAmo Flash SYBR Green qPCR試驗盒、細胞周期蛋白(CCN)D1抗體(ab134175)、β-actin抗體(ab8226)分別由美國Gibco、美國Invitrogen公司和美國abcam公司提供；噻唑藍(MTT)藥物、膜聯蛋白(Annexin)-V/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒由上海生工生物有限公司提供。

1.3qRT-PCR RNA由Trizol試劑按說明書提取。按說明分別組建RT-PCR及real-time PCR體系。RT-PCR條件：反轉錄，50℃ 30 min；變性，94℃ 2 min；共1循環。Real-time PCR條件：變性，94℃ 15 s；退火，60℃ 30 s；延伸，68℃ 3 min；共40循環；最后延伸，72℃ 10 min。通過2-△△Ct法計算基因相對含量。

1.4慢病毒感染 將TE-1細胞以合適密度接種于6孔板中。過夜培養后洗滌細胞。慢病毒感染分組：miR-134組每孔包括2 ml含血清DMEM、1 ml的miR-134慢病毒顆粒及15 μg聚凝胺；miR-NC組每孔包括2 ml含血清DMEM、1 ml的陰性對照慢病毒顆粒及15 μg聚凝胺。轉染2 d后，使用特性抗生素溶液篩選穩定轉染TE-1細胞。

1.5MTT實驗 TE-1細胞分別轉染24、48和72 h，按每孔2×104個細胞接種96孔板，每個時間點設置6個平行對照。培養過夜后加入MTT溶液，再次避光培養4 h。吸凈上清后每孔用150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解MTT結晶。酶標儀讀取490 nm處的OD值。

1.6平板克隆形成試驗 在6孔板中均勻接種穩定轉染的TE-1細胞，每孔約500個。培養2 w后，多聚甲醛固定細胞、1%結晶紫染色、蒸餾水漂洗、通風櫥內風干培養板。計數克隆數量，百分法計算克隆形成率。

1.7流式細胞儀分析 轉染72 h后的TE-1細胞用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，胰酶消化后低速離心獲取細胞沉淀，取兩份含5×105個細胞的細胞懸液，一份與10 μl PI溶液混合做細胞周期分析；一份與5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI混合上機檢測細胞凋亡。

1.8Western印跡 細胞總蛋白采用RIPA法提取，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，70 V濕轉120 min轉印目標蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉2 h后將目標條帶分別置入CCND1和β-actin一抗溶液中在4℃下孵育過夜。1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗在室溫中孵育目標條帶1 h。電化學發光(ECL)法顯影，自動曝光機固定條帶影像，計算蛋白相對表達量。

1.9統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1ESCC組織中miR-134的表達 miR-134在癌旁組織中的表達量(1.377±0.052)顯著高于ESCC組織(0.988±0.051；t=5.311，P<0.001)。

2.2miR-134對TE-1細胞增殖及細胞凋亡的影響 miR-134組中miR-134的表達顯著高于miR-NC組(14.27±4.03 vs 1.00±0.00；t=8.031，P<0.001)。MTT實驗表明，感染72 h后，miR-134組細胞活力與miR-NC組相比顯著下降(0.58±0.09 vs 0.71±0.08；t=3.378，P=0.023)。平板克隆形成試驗結果表明，與miR-NC組比較，miR-134組顯著下調了TE-1細胞的克隆形成能力〔(85.32±10.68)% vs (39.18±13.07)%；t=3.022，P=0.029〕。見圖1。

圖1 各組平板克隆形成試驗(×100)

流式細胞系統檢測結果表明，與感染miR-NC組相比，miR-134組細胞凋亡率明顯升高〔(12.16±5.23)% vs (37.28±6.14)%;t=4.382，P=0.010〕。見圖2。

2.3miR-134對TE-1細胞中CCND1表達的影響 通過生物信息學檢索發現CCND1的表達可能受到miR-134的靶向調節。見圖3。與miR-NC相比，miR-134組TE-1細胞內CCND1 mRNA(1.00±0.00 vs 0.43±0.15;t=4.031，P=0.011)及蛋白(0.43±0.16 vs 0.12±0.03;t=2.106，P=0.042)水平均顯著降低。見圖4。這一結果提示CCND1是miR-134的作用靶點之一。

圖2 流式細胞儀檢測兩組細胞凋亡率

圖3 miR-134與CCND1 mRNA 3′-UTR結合位點

圖4 Western印跡檢測兩組CCND1蛋白表達

3 討 論

miR-134位于人類第14號染色體。神經科學研究顯示，miR-134對維持生物記憶有重要作用〔7〕，miR-134在神經細胞內表達的維持對減輕癲癇所致神經損傷有重要作用〔8〕。

本研究中通過qRT-PCR檢測得知ESCC組織中miR-134的表達水平顯著下調，提示miR-134在食管癌中扮演潛在抑癌角色。進一步研究發現，在體外培養環境中，miR-134能夠削弱癌細胞活力、增殖能力，并可以促使細胞發生凋亡。有文獻報道，miR-134在消化道腫瘤〔9〕轉移及肺腫瘤〔10〕耐藥中也有調節作用。這些現象充分說明了miR-134的多重抗癌作用，值得深入探究。

miRNA對靶基因具有負向調節作用，其機制是通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(3′-UTR)區特異性結合而實現的。通過在線數據檢索發現，CCND1 mRNA的3′-UTR存在miR-134的結合位點。進一步實驗發現，人為升高miR-134對CCND1的表達具有負向調節效果。CCND1是已知的促食管癌增殖因子〔11，12〕。上述實驗證明，miR-134對CCND1的表達調節作用可能是miR-134發揮抗食管癌的機制之一。