丁苯酞注射液對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮質區星型膠質細胞、β-catenin表達量及細胞凋亡的影響

逯冉冉 耿建紅 張群英 付文玉 趙敏

(濰坊醫學院 1神經病學教研室，山東 濰坊 261053；2組織與胚胎學教研室)

研究表明，腦缺血再灌注(I/R)損傷機制是一系列復雜的病理生理過程，急性腦I/R可導致嚴重的遲發性腦神經元損傷，可能是由于缺血再灌注周圍腦組織發生炎癥反應和細胞凋亡，加劇了腦組織水腫和神經元的進一步損傷〔1,2〕。丁苯酞(NBP)是從芹菜籽中提取而來的有效成分，廣泛用于治療各種腦血管病。臨床研究發現，NBP在全面治療缺血性腦卒中有明顯減少梗死后神經功能缺失、改善患者生活能力狀態的作用〔3〕，但NBP對腦I/R大鼠神經元具體保護機制尚未十分明確。本實驗通過建立局灶性腦I/R大鼠模型檢測各組含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase8、β-連環蛋白(catenin)蛋白表達量，星型膠質細胞的數量和形態改變，從而探討NBP的神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 NBP注射液(石藥集團恩必普藥業有限公司生產提供)，主要試劑包括caspase3、caspase8(Life Science試劑公司)、β-catenin(CST試劑公司)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗兔(abcom試劑公司)。

1.2實驗動物分組及處理 動物選取清潔級健康的成年雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，青島大任富城畜牧有限公司提供。動物每籠3～4只飼養，室溫維持在(23±2)℃，自由攝水攝食。將大鼠隨機分為4組：假手術(Sham)組、模型(I/R)組、BNP低劑量(NBP1)組、NBP高劑量(NBP2)組。

1.3動物模型的制備 參照Longa等〔4〕線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MACO)的局灶性腦缺血模型。經腹腔注射10%水合離醛麻醉大鼠。使其仰臥位置于手術操作臺上，頸部正中切口鈍性分離頸下皮膚肌肉，充分暴露一側的頸部動脈。分離頸內外動脈，結扎頸外血管，將魚線由頸總動脈插入頸內血管到達大腦中動脈。魚線至頸內外分叉口18 mm，結扎頸總動脈。檢查無出血后，依次縫合頸部組織和皮膚，1.5 h后拔出栓線，放置籠中觀察直至清醒，并正常飼養。NBP1組和NBP2組大鼠分別在術后6 h、12 h、24 h腹腔注射BNP溶液(4 mg/kg、6 mg/kg)，Sham組和I/R組注射等量生理鹽水。

1.4大鼠行為學評分及腦組織含水量測定 大鼠再灌注24 h后進行神經功能評分，參照文獻〔5〕評分標準：0分，無神經功能缺損癥狀；1分，輕微神經功能缺損，不能完全伸展向對側前爪；2分，重度局灶性神經功能缺損，向對側轉圈；3分，重度局灶性神經功能缺損，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。評分后將大鼠立即斷頭處死，取缺血側腦組織迅速稱其濕重，然后置于100℃高溫烤箱內，烘干48 h后稱其干重。按照Elliott公式，計算腦含水量，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5免疫熒光組織化學染色 各組SD大鼠缺血再灌注24 h后每組隨機選取5只，用10%水合氯醛進行腹腔麻醉。由左心室進針入升主動脈剪開右心耳，生理鹽水200 ml快速沖凈血液，4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)400 ml緩慢灌注固定后取腦；將腦組織依次放置濃度為20%、30%蔗糖溶液梯度沉糖脫水2次。包埋劑包埋腦組織，冰凍切片機切片厚度10 μm；采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)法進行免疫組化染色，冰凍切片室溫下復溫20 min，PBS洗滌3次×5 min，山羊血清封閉30 min，滴加一抗4℃過夜，次日復溫30 min，PBS洗滌3次×5 min；熒光二抗避光孵育1 h，PBS避光洗滌3次×5 min，Hoechest33258避光染色30 min，PBS避光洗滌3次，抗免疫熒光劑封片。在熒光顯微鏡400倍視野下，采集拍照；采用 Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對結果進行定量分析，測定平均光密度值(IOD)進行統計學分析。

1.6Western印跡檢測蛋白水平 各組大鼠缺血再灌注24 h后，麻醉斷頭處死，迅速取出缺血側腦皮質。 加入蛋白組織裂解液冰上研磨勻漿，提取各組樣本的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，將各組蛋白終濃度調整一致。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)垂直板全濕法電泳，上樣，電泳，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入含 5%脫脂牛奶的TBST封閉緩沖液中封閉2 h后加入稀釋的一抗(1∶1 000)。一抗4℃搖床孵育過夜，室溫下復溫1 h，充分洗膜后加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后發光液化學發光，使用膠片進行曝光。

1.7統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組β-catenin、caspase3、caspase8蛋白表達 各組皮質區均能檢測到β-catenin、caspase3、caspase8蛋白條帶。I/R組caspase3、caspase8的蛋白表達量明顯高于Sham組，而β-catenin卻顯著低于Sham組(P<0.05)。NBP1組和NBP2組與I/R組相比，明顯下調了β-catenin蛋白，降低了caspase3、caspase8蛋白的表達量(P<0.05)。NBP2組與NBP1相比caspase3、caspase8蛋白顯著降低，β-catenin顯著上調(P<0.05)，見圖1、表1。

組別Caspase3Caspase8β-cateninSham組0.03±0.040.10±0.050.93±0.11I/R組0.24±0.071)0.42±0.091)0.59±0.0081)NBP1組0.17±0.052)0.33±0.062)0.66±0.0062)NBP2組0.13±0.082)3)0.26±0.072)3)0.75±0.072)3)

與Sham組比較：1)P<0.05；與I/R組比較：2)P<0.05；與NBP1組比較:3)P<0.05；下表同

2.2神經功能評分和腦水腫含水量測定 Sham組未觀察到任何神經功能損傷，NBP1組及NBP2組評分明顯低于I/R組，且NBP2組顯著低于NBP1組(P<0.05)。NBP1組及NBP2組腦含水量均顯著低于I/R組(P<0.05)，且NBP2組顯著低于NBP1組(P<0.05)。見表2。

表2 各組行為學評分及腦組織含水量比較

2.3NBP對神經元細胞的影響 I/R組星型膠質細胞肥大，增生，胞核深染，呈過度激活狀態。NBP1組及NBP2組星型膠質細胞僅少量細胞激活，隨著劑量增加細胞激活量降低，兩組激活程度均顯著低于I/R組(P<0.05)。I/R組大部分細胞出現凋亡，細胞核變小，核染色質高度凝集甚至破碎，呈強亮色熒光；NBP1組及NBP2組強熒光細胞即凋亡細胞數量明顯減少(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組GFAP和Hoechest染色積分光密度(IOD)值比較

圖2 大鼠腦缺血再灌注24 h后各組星型膠質細胞激活狀態和細胞核破碎程度表達(×400)

3 討 論

研究發現，NBP在阿爾茨海默病和腦卒中動物模型中都具有顯著的神經保護作用〔6，7〕。BNP治療缺血性腦卒中作為一個多目標神經保護活性劑，通過減少氧化損傷和抑制炎癥反應，顯著改善線粒體功能減少神經元凋亡〔8〕。目前NBP已廣泛應用于臨床治療腦卒中患者并有顯著成效，NBP不僅能夠改善患者急性腦損傷而且可以改善腦卒中后導致行走、肢體運動方面的殘疾及感覺、語言和記憶力等〔9,10〕。

當腦組織血流中斷后依次會導致氧化應激和炎癥反應，最終引起神經元死亡，當缺血一定時間后再灌注會進一步加劇凋亡程度〔11〕。細胞凋亡是腦I/R損傷最嚴重結果，其中caspase基因家族中的caspase3和caspase8在細胞凋亡的發生發展中起重要作用〔12〕。研究表明在短暫局灶性腦缺血大鼠中 β-catenin表達下降，影響細胞周期的調節〔13〕。β-catenin蛋白對神經元和中樞神經系統的發育起重要作用，在胚胎發育過程中Wnt蛋白主要通過調節β-catenin控制基因轉錄和激活〔14〕。同時有研究發現β-catenin在細胞凋亡中發揮重要作用，其中主要是通過Wnt/β-catenin信號通路調節細胞增殖、裂解及細胞間的極性和連接〔11〕。當β-catenin突變的胚胎發育過程中去除β-catenin基因可誘發凋亡，導致神經脊細胞、感覺神經元、背根神經節、后腦等組織的損傷〔15，16〕。此外，結腸腺瘤樣息肉病基因(APC)作用于β-catenin，降解清除β-catenin后導致核內轉錄因子T細胞因子(TCF)/淋巴細胞增強因子(LEF)的轉活減少，當TCF/LEF失活后APC基因可進一步誘導caspase3、caspase7和 caspase8的激活及增強聚合酶(PARP)分裂導致細胞凋亡易發性〔17〕。

本實驗研究發現大鼠腦I/R 24 h后BNP組行為學評分和腦水腫程度均低于I/R組，進一步證實NBP對大鼠腦I/R損傷有顯著保護作用。NBP預處理后上調了β-catenin表達量，降低了細胞激活和凋亡的程度，并隨著濃度的升高保護作用加強。

綜上所述，NBP可能是通過上調 β-catenin蛋白表達，同時減弱APC基因對caspase3和caspase8的活化，來降低星型膠質細胞過度激活和神經元細胞的凋亡，從而對腦I/R大鼠神經元損傷和細胞凋亡起到保護作用。