間質性肺病小鼠循環纖維細胞與血清KL-6的相關性

王慧選 徐敏紋 鹿莉 殷寒秋 殷松樓 馬華

(徐州醫科大學附屬醫院風濕免疫科，江蘇 徐州 221000)

間質性肺病(ILD) 是以不同程度的肺泡炎癥和肺纖維化為病理特征的一類肺部疾病。約1/3的ILD患者繼發于結締組織疾病，ILD常導致肺功能降低，5年生存率為20%〔1〕。已知成纖維細胞在ILD病理發生發展中具有重要作用，循環纖維細胞是成纖維細胞的重要來源之一〔2〕。雖然有研究將循環纖維細胞作為ILD的生物學標志物〔3〕，但尚未得到廣泛共識。血清Ⅱ型肺泡表面抗原(KL)-6糖蛋白為ILD病理進展和預后的生物學標志物〔4，5〕。本實驗觀察博來霉素(BLM)誘導的ILD 小鼠不同病程階段外周血循環纖維細胞數量和KL-6濃度的關系。

1 材料和方法

1.1材料 9～10周齡SPF級雌性昆明小鼠40只(購于徐州醫科大學實驗動物中心)，重量(20.00±0.93)g。戊巴比妥鈉購于北京索萊寶科技有限公司；BLM針劑為日本化藥株式會社，15 mg/支；固定與透膜試劑盒、Percp 標記抗小鼠 CD45 購自BD公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)抗體購自Rockland 公司；熒光素(FITC)標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自上海貝博生物；小鼠KL-6酶聯免疫分析試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；Masson染色試劑盒和羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；流式細胞儀為BD LSRFortessaTM Cell Analyzer。

1.2分組與模型建立 實驗小鼠隨機分為模型組(A組)和對照組(B組)各20只。適應性飼養后腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)，麻醉后切開頸部逐層分離組織暴露氣管。A組用1 ml注射器吸取5.0 mg/kg的BLM溶液，緩慢滴入氣管，滴入過程中將小鼠直立，使BLM溶液在肺內分布均勻，同時觀察小鼠呼吸情況。B組小鼠經氣管滴入等體積的生理鹽水作為陰性對照。

1.3循環纖維細胞檢測 兩組均在BLM給藥后第7、14、21、28天眼球取血法各處死5只，取200 μl肝素鈉抗凝血于流式管中，CD45單抗25 ml(0.02 mg/ml)，渦旋器震蕩混勻，室溫避光孵育15 min；離心機2 000 r/min離心5 min后，加入固定透膜液500 μl(1∶1)，4℃孵育20 min；每管加透膜洗滌液1 ml(1∶10)，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重復上述操作1次；每管加兔抗小鼠ColⅠ抗體2 μl(0.01 mg/ml)，4℃避光孵育30 min，洗滌2次；每管加FITC 標記的山羊抗兔抗體27 μl(0.04 mg/ml)于管底，4℃避光孵育30 min，洗滌2次后，最后以300 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞。流式細胞儀檢測，每管獲取1×105個細胞，原始數據采用FloJo-V10軟件處理。

1.4血清KL-6檢測 將取得的全血8 000 r/min離心5 min，取血清。按小鼠KL-6酶聯免疫分析試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中KL-6濃度。

1.5肺組織炎癥、纖維化程度的病理學分析 右肺組織經4%多聚甲醛通用型組織固定液固定、脫水、石蠟包埋，石蠟切片機制作3 μm的石蠟切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色及按照Masson染色試劑盒說明書進行染色。觀察肺組織炎癥改變，觀察肺組織膠原沉積情況。肺部炎癥評分：0分為無炎癥細胞，1分為少量炎癥細胞，2分為輕度炎癥，3分為中度炎癥，4分為重度炎癥；肺部纖維化評分采用Ashcroft半定量法〔6〕：0分為正常的肺組織；1分為肺泡或細支氣管壁輕微增厚；3分為細支氣管壁或肺泡壁增厚，肺泡結構無明顯破壞；5分為纖維化程度增加，肺泡結構受到一定程度的破壞，有小纖維團形成；7分為肺泡結構受到嚴重破壞，大面積纖維化；8分為肺幾乎完全纖維化(2、4、6分為1、3、5分的過渡階段)。

1.6肺組織羥脯氨酸測定 取左肺組織按照羥脯氨酸試劑盒說明書進行操作，分光光度儀檢測羥脯氨酸含量。

1.7統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1肺組織病理學改變 HE染色顯示：A組第7天肺間隔增寬且有大量炎癥細胞浸潤；14 d肺部組織基本消失，肺泡結構幾乎不可見；第21天肺部斑片化；28 d斑片面積減少。B組各個時期病理改變較A組輕(圖1)。Masson染色顯示：A組第7天開始出現少量膠原纖維沉積，到14 d達到最高，隨后逐漸減少。B組各時期的膠原纖維沉積程度較A組輕(圖2)。

2.2肺部炎癥及纖維化評分 A組炎癥評分在第7、14、21天時均顯著高于B組，差異有統計學意義(P<0.01)，A組纖維化評分各時期均顯著高于B組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.3羥脯氨酸含量 A組羥脯氨酸含量在第14天達到最高，隨后逐漸下降，A組各時期羥脯氨酸含量均顯著高于B組(P<0.01)，見表2。

2.4外周血循環纖維細胞 A組循環纖維細胞第7天達到最高，在第7、14、21天均顯著高于B組(P<0.01)，見表3。

圖1 兩組肺組織HE染色(×200)

圖2 兩組肺組織Masson染色(×200)

組別炎癥評分第7天第14天第21天第28天纖維化評分第7天第14天第21天第28天A組2.80±0.571)3.60±0.421)2.60±0.421)1.50±0.793.00±0.621)3.80±0.571)4.20±0.571)3.20±0.571)B組0.90±0.420.70±0.270.30±0.270.30±0.270.80±0.270.50±0.350.20±0.270.10±0.22

與B比較:1)P<0.01；表2同

表2 兩組肺組織羥脯氨酸含量

表3 兩組外周血循環纖維細胞百分比

2.5血清KL-6濃度 A組血清KL-6濃度第21天達到最高，在第14、21、28 d顯著高于B組(P<0.05)，見表4。

2.6循環纖維細胞百分比與肺組織炎癥、纖維化評分、羥脯氨酸含量、血清KL-6濃度的相關性 Spearman分析結果顯示，循環纖維細胞百分比與肺組織炎癥評分、纖維化評分、羥脯氨酸含量、血清KL-6濃度呈正相關(r=0.631、0.676、0.764、0.454，n=40，P<0.01)。

表4 各組血清KL-6濃度

3 討 論

循環纖維細胞是存在于外周血中的一類新的白細胞亞型，在正常人群中占外周有核細胞的0.1%～1.0%。Hashimoto等〔7〕在BLM誘導長期移植表達增強型綠色熒光蛋白轉基因小鼠的肺損傷模型中，發現肺部表達膠原的細胞很大比例是骨髓來源的外周循環纖維細胞。循環纖維細胞同時具有血源性細胞和成纖維細胞的特征，因此，標志物CD45和ColⅠ雙陽性常用來鑒別循環纖維細胞〔8〕，本研究結果顯示外周血循環纖維細胞數量變化與ILD病理進展一致。由于循環纖維細胞具有上述特征，因此其有可能參與ILD的炎癥及纖維化進程〔9〕，本研究提示循環纖維細胞可能參與BLM誘導小鼠ILD的炎癥和纖維化進程。

KL-6是一種高分子量的肺細胞糖蛋白標記物，在肺組織中由肺泡Ⅱ型上皮細胞和支氣管上皮細胞分泌，KL-6在肺組織細胞損傷反應和再生后增加，在ILD中升高，參與ILD的病理生理過程。因此，KL-6常被作為ILD病情監測和預后的生物學標志物〔5〕，既往臨床研究也證實了這一觀點〔10〕。本實驗結果顯示循環纖維細胞數量與血清KL-6水平呈正相關，表明循環纖維細胞可作為ILD評估病情的生物學標志物。

本實驗未涉及循環纖維細胞參與ILD的機制，有待進一步深入研究。因小鼠與人體的差異性，因此該動物實驗結果可能與臨床結果有差異，需進一步臨床研究驗證。