神經肌肉電刺激對腦血管病大鼠模型神經元tau蛋白表達和氧化應激水平的影響

王玉輝 郝學喜 崔寶娟

(山東大學第二醫院 1康復科，山東 濟南 250033；2急診醫學中心)

神經肌肉電刺激(NMES)是利用低頻電流，一般頻率為25～50 Hz，刺激機體特定組織神經或肌肉，引起肌肉收縮或抽搐，進而提高肌肉功能，達到修復效果〔1〕。由于NMES其本質是作用于目標肌肉群的神經，所以應用NMES的先決條件是目標肌肉群具有完整的神經〔2〕。它常用于由于手術、外界傷害等造成的無法進行長期活動的人群，使用NMES儀進行肌肉訓練，進而保持肌肉力量和質量、增加關節自主活動、促進肌肉自我良好控制，減少痙攣。近年來，除了商用的NMES儀廣泛使用外，家用的NMES儀也已經被大量發展起來，目前正越來越廣泛地應用于各種疾病的康復治療中，病人方便自己獨立使用。但其具體的作用機制，我們仍在不斷探索中〔3〕。

腦血管病包括動脈粥樣硬化、腦血栓等，由于當今社會人們的飲食環境，血稠、腦組織血液循環慢等問題暴露，逐漸造成腦組織認知功能減退等癥狀，疾病發展呈顯著遞增趨勢〔4〕。尤其在老年人群中，患病率更高。有研究發現，除外界環境外，機體氧化應激是引起腦部疾病的重要影響因素之一，腦組織氧化還原系統失衡，自由氧產生過多，使缺血性損傷加重〔5〕。因此，有效干預氧化應激也是保護腦組織受損的方法之一。

tau蛋白是微管相關蛋白中含量最高的蛋白，它是神經細胞的骨架成分，參與多種細胞功能〔6〕。Tau蛋白含有磷酸基蛋白，若產生腦部疾病，其磷酸化程度加深，常表現為過度磷酸化，會使人喪失正常活動功能〔7〕。本研究旨在探討NMES對腦血管病大鼠模型，神經無tau蛋白表達和氧化應激水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取健康SPF級雄性SD大鼠30只，體重(252±3.4)g，購買于北京斯貝福生物技術有限公司，由山東大學第二醫院動物實驗中心自養21 d。隨機均分為三組:空白對照組(B組)，腦血管病模型組(C組)和NMES組(N組)，每組10只。每天正常自由飲水進食，飼喂相同飼料，所有大鼠正常活動，無疾病，適合實驗。鼠房為屏障系統動物房，溫度(25±2)℃，相對濕度50%～60%，每天12 h(8∶00～20∶00)照明。動物實驗的操作與處理由該研究中心動物保健與使用委員會批準，符合國家實驗動物倫理委員會的操作指南，遵循實驗動物倫理要求。

1.2動物實驗飼料 購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心(北京)。

1.3實驗方法

1.3.1腦血管病大鼠模型的建立 大鼠適應性飼養1 w，飼喂普通飼料，觀察其生長情況。從第8天開始造模，腹腔注射麻醉，麻醉劑內容物為12%的水合氯醛，量控制在2.5 ml/kg，避免麻醉過深。SD大鼠經麻醉后，將大鼠俯臥放置于動物實驗臺上并將其固定在一個立體分類框架中。C組和N組于大鼠雙側頸總動脈采用結扎的方法建立SD大鼠腦血管病模型。術前禁食12 h，斷水4 h，頸前部去毛、消毒，剪取頸正中央切口，分離雙側頸總動脈，分別用兩股絲線結扎，術后送動物房飼養。造模第3天開始進行NMES治療。N組使用NMS儀對大鼠前肢肌肉進行電刺激，頻率設定100 Hz，電流5～6 mA，脈寬300 ms，1次/d，進行15 min。B組不構建腦血管病模型，亦不進行NMES治療。實驗期間檢測各組大鼠體重、攝食量變化，計算臟器指數、脂肪系數和食物利用率等。每天記錄給食量、剩食量和撒食量，每7 d測定一次體重。

1.3.2大鼠狀態的觀察 觀察造模前后各組大鼠眼睛神態、毛色變化、攝食量、飲水量、排便排尿量及活動狀況等變化。

1.3.3大鼠Tau 蛋白磷酸化的測定 造模第21天后，各組大鼠用12%的水合氯醛10 mg/kg進行注射，120 ml的生理鹽水快速沖洗，再用偏中性的4%的多聚甲醛每只250 ml注射，隨后速度減慢注射相同劑量。解剖去除腦部組織，使用4%的多聚甲醛浸泡24 h，免疫組化方法進行染色，嚴格按照試劑盒說明進行操作(購買于上海通蔚生物科技有限公司)，光學顯微鏡下進行觀察。

1.3.4實時熒光定量(RT)PCR法測定mRNA相關基因表達 采用Trizol法提取大鼠腦組織總RNA，采用分光光度計法，分別在280 nm波長和260 nm波長吸光度下，計算RNA原液濃度和OD260/OD280。根據RNA原液濃度及試劑盒說明調整RNA濃度，使RNA稀釋液濃度為500 ng/μl。按試劑盒要求配制反應體系，反應條件為:37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，10 min。合成的cDNA保存于-20℃。定性分析腦組織中(PI3K)和(Akt)基因的mRNA含量〔8,9〕。設置引物序列。擴增條件：預變性 95℃ 10 min；變性94℃ 30 s；退火/延伸60℃ 1 min；融解曲線分析94℃ 15 s，60℃ 1 min，94℃ 15 s，60℃ 15 s。反應體系：前引物(5 μmol/L)1 μl，反向引物(5 μmol/L)1 μl，2×PCR 預混液10 μl，DNA模板1 μl，無酶無菌水7 μl。

嚴格按照試劑盒說明書進行操作，結果以2-△△Ct表示。

計算公式如下:

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

1.3.5丙二醛(MDA)含量的測定 大鼠腦組織中MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行測定。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行(購自于上海通蔚生物科技有限公司)。

計算公式如下:

1.3.6超氧化物歧化酶(SOD)含量的測定 大鼠腦組織中T-SOD含量采用羥胺法進行測定。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行(購自于上海通蔚生物科技有限公司)。

政府是創新體系的主導者而非獨斷者，因此需要不斷推進體制改革，發揮組織者的優勢，優化資源配置，充分利用社會資源，為政府公共服務的創新提供最有力的支持。

計算公式如下:

定義:每毫升反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。

1.3.7PI3K和Akt基因蛋白含量的測定 取腦組織后加入細胞裂解液勻漿25 min，4℃，15 000 r/min離心15 min，離心后取組織上清液。嚴格按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明測定PI3K和Akt基因蛋白含量。PI3K和Akt檢測試劑盒均購自合肥博美生物科技有限公司。每組取45 μg樣品，加緩沖液使蛋白變性，跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將反應條帶進行光密度測定，蛋白表達的相對水平為條帶光密度比值。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠Tau 蛋白磷酸化表達 經測定，與B組相比，C組和N組大鼠Tau蛋白染色較明顯，在C組中表現為過度磷酸化，CA1區較為明顯(P<0.01)。使用電刺激治療后，N組磷酸化程度明顯減輕(P<0.01)。見表1。

表1 Tau 蛋白磷酸化表達

與對照組比較：1)P<0.05；與肺損傷組比較：2)P<0.05

表2 各組大鼠mRNA的PI3K及Akt基因相對表達量

與B組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05，下表同

2.3電刺激對大鼠MDA含量和SOD活性的影響 NMES對大鼠MDA含量和SOD活性進行測定。經實驗測定發現，與B組相比，C組和N組MDA含量顯著上升(P<0.05)，電刺激后，N組大鼠呈現下降趨勢(P<0.05)，證明NMES對大鼠MDA含量有緩解的作用。N組大鼠SOD水平較B、C兩組呈現顯著上升趨勢(P<0.05)，電刺激對抗氧化的治療效果較好。見表4。

2.4NMES對PI3K、Akt蛋白含量的測定 通過Western印跡實驗對三組大鼠PI3K、Akt的蛋白表達量及內參物GADPH進行測定。患有腦血管病顯著的抑制了PI3K、Akt的表達(P<0.05)，基因下調。相比之下，電刺激后N組大鼠提高了相關基因蛋白的表達水平(P<0.05)。見圖2、表5。表明N中PI3K、Akt基因與失活的C組模型大鼠相比顯著被激活。

圖1 RT-PCR檢測基因mRNA表達情況

表3 實時熒光定量PCR引物序列

表4 各組大鼠MDA與SOD含量的影響

圖2 各組大鼠PI3K、Akt基因蛋白含量的表達水平

組別PI3KAktB組1.64±0.58 1.83±0.78C組0.74±0.211) 0.85±0.331)N組1.05±0.451)2) 1.26±0.381)2)F/P值23.764/0.00126.460/0.001

3 討 論

腦血管病發病率和死亡率正逐年上升〔10,11〕。NMES是腦部疾病康復治療的重要手段之一，其有效利用對緩解腦血管病具有重要作用。我們通過促進腦血管病大鼠恢復肢體功能是通過刺激內源性神經干細胞增殖而進行的。其作用機制可能與刺激神經網絡，增強突觸效能有關〔12～14〕。

Tau蛋白是一類微管相聯蛋白，具體親水性。雙股螺旋纖維絲(PHF)的主要成分是Tau蛋白，存在于正常神經元纖維中，可促進軸突對神經遞質的運輸〔15〕。在一個正常成年人體中，tau蛋白是主要的磷酸蛋白，蛋白磷酸化會破壞其結構，導致生物體穩態的改變〔16〕。因此，保護蛋白結構，避免磷酸化具有重要作用。而蛋白磷酸化的程度主要取決于蛋白激酶和蛋白磷酸酶之間的平衡。NMES可減輕tau蛋白的磷酸化原理是降低了蛋白激酶活性，使tau蛋白去發生脫磷酸作用，最終致使過度磷酸化的tau蛋白生產量減少或使蛋白磷酸酶的活性降低〔17〕。但是我們發現，自由基的生成使磷酸酶易被氧化，酶活性降低。此外，氧化應激還導致了晚期糖基化終末產物(AGE)的生成，AGE可以對tau蛋白進行修飾，修飾后的tau蛋白結構較穩定。因此，有效抵抗氧化應激也具有重要作用。本實驗中，神經肌肉電刺激能有效清除自由基，可阻止神經細胞被自由基破壞。本研究結果說明電刺激可降低大鼠腦中磷酸化tau蛋白的水平并通過清除自由基的途徑抑制氧化應激反應〔18〕。進而證實了自由基的損傷參與了神經元tau蛋白過度磷酸化的病理過程。

另外，SOD是體內氧自由基清除的一類重要的抗氧化酶，尤其在中樞神經系統中。同時是自由基清除系統的重要組成成分。MDA是脂質過氧化的最終產物，是氧自由基的重要介質可作為評價衰老的重要指標，用來反映氧自由基損傷程度的大小〔19〕。本研究結果表明，氧化應激反應也是引起神經元損傷的重要原因。二者與機體氧化還原平衡狀態密切相關。但是什么導致腦血管病引起的氧化損傷的原因至今尚不清楚，還需做進一步研究驗證說明。

Akt在PI3K/Akt途徑中發揮著十分重要的作用，它是促細胞生存的一個重要激酶〔20〕。tau蛋白組中的Akt基因被激活，神經肌肉電刺激對腦血管病大鼠磷酸化程度有所緩解，Akt能增強GADPH的mRNA的穩定性，使GADPH在mRNA和蛋白水平均表現為抑制，可有效降低tau蛋白表達〔21〕，我們猜測其作用機制可能與抑制PI3K/Akt通路的表達有關。本研究的創新點在于首次通過電刺激在PI3K/Akt信號通路中研究神經元tau蛋白表達情況和氧化應激水平。