頂空固相微萃取-氣相色譜/質譜聯用法結合化學計量學分析白肋煙烘焙前后揮發性、半揮發性成分

鄧 波, 王維維, 張小濤, 童福強, 姬厚偉, 劉與銘, 張 麗

(貴州中煙工業有限公司技術中心, 貴州 貴陽 550009)

白肋煙是混合型卷煙的重要原料,未經處理的白肋煙含糖量低,煙堿和總氮含量高,吸味品質表現為具有白肋煙特征香氣,但余味較差,刺激性和勁頭較大,地方性雜氣和氨氣較重[1-3]。白肋煙處理工藝是影響混合型卷煙品質的關鍵因素之一,主要包括重加里料和高溫烘焙[4]。重加里料主要用來彌補白肋煙自身含糖量的不足,進而達到降低煙氣pH、協調煙氣和增加香味的作用[5];高溫烘焙則有助于料液與煙葉化學成分發生焦糖化作用和美拉德反應等,產生香味物質,提高卷煙的吸食品質,且有助于減少地方性雜氣、減輕刺激性和改善余味[6]。國內外對白肋煙處理工藝研究較多,主要是通過控制加料含水率、烘焙溫濕度、烘焙時間、干燥終端含水率等工藝參數來控制白肋煙的處理質量,工藝參數的確定主要依賴于處理后白肋煙的評吸結果[7,8],評吸結果主觀性強、易受評吸人員狀態及環境影響。深入研究烘焙前后白肋煙香氣成分的變化規律可為白肋煙工藝參數優化及白肋煙處理效果評價提供客觀、可靠的支撐,找到適合國內白肋煙處理的最優工藝參數,進而提高混合型卷煙產品質量。

固相微萃取(SPME)具有無需前處理、樣品用量少、選擇性強、靈敏度高等優點,常與GC/MS聯用測定揮發性、半揮發性成分[9,10],被廣泛用于食品[11-14]、生物[15-17]、醫學[18,19]、環境[20-22]等領域。本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜/質譜法(HS-SPME-GC/MS)技術對白肋煙中的揮發性、半揮發性成分進行測定,并采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)比較白肋煙烘焙前后化學成分的變化,為白肋煙烘焙效果的評價和白肋煙烘焙參數的優化提供有效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CP224S型電子分析天平(感量0.000 1 g,德國Sartorius公司);配有TriPlus RSHTM自動進樣器的Thermo Trace1310-ISQ GC-MS氣相色譜/質譜聯用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。固相微萃取纖維頭:活性炭/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS),膜厚85 μm;二乙烯基苯/活性炭/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS),膜厚50/30 μm;聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB),膜厚65 μm;聚乙二醇(PEG),膜厚60 μm;聚丙烯酸酯(PA),膜厚85 μm(美國Supelco公司)。

乙酸苯乙酯(純度99%)和79種標樣(純度均≥97%)(北京J&K公司);丙酮(色譜純,美國TEDIA公司)。

2批次白肋煙煙葉處理過程中烘焙入口和烘焙出口各取3個樣本,每個樣本重復測定2次(B-1-1～B-1-6、B-2-1～B-2-6為烘焙入口樣品,A-1-1～A-1-6、A-2-1～A-2-6為烘焙出口樣品),所有樣品研磨成粉后過40目篩,并保存于4 ℃冰箱。

1.2 SPME條件

準確稱取0.020 0 g煙粉裝入20 mL頂空瓶中,加入1 μL 20 μg/mL乙酸苯乙酯和氘代苯酚的丙酮溶液(內標),然后蓋上磁性頂空瓶蓋待測。

固相微萃取纖維頭:65 μm PDMS/DVB;孵化溫度:60 ℃,孵化時間:8 min,萃取時間:40 min;解吸溫度:250 ℃;解吸時間:3 min;老化時間:30 min。

1.3 頂空條件

準確稱取1.000 0 g煙粉樣品裝入20 mL頂空瓶中,加入1 μL 20 μg/mL乙酸苯乙酯和氘代苯酚的丙酮溶液(內標),然后蓋上磁性頂空瓶蓋待測。

樣品平衡溫度:80 ℃;樣品平衡時間:40 min;進樣方式:加壓恒時;進樣壓力:130 kPa;進樣時間:0.5 min。

1.4 GC-MS條件

色譜柱:DB-WAXETR毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純He,純度99.999%;流速:1.0 mL/min;進樣口溫度:250 ℃;進樣模式:不分流進樣;升溫程序:40 ℃保持2 min,以4 ℃/min的速度升至200 ℃,保持1 min,然后以10 ℃/min的速度升至240 ℃,保持10 min。

離子源:電子轟擊(EI);電子能量:70 eV;離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:240 ℃;質量分析器:四極桿;掃描模式:SIM+SCAN; SCAN質量掃描范圍:29～400 amu。

1.5 數據分析

利用自動質譜圖解卷積和鑒定系統(AMDIS)對共流出色譜峰進行解卷積,利用Xcalibur軟件的processing setup編輯自動積分方法,然后利用Quan Browser功能對自動積分結果進行手動校正,生成一個包含樣品信息、保留時間和相對峰面積(峰面積與內標峰面積比值)的三維矩陣。

應用SIMCA-P14.0軟件(瑞士Umetrics公司)對數據進行標準化處理后,進行PCA、PLS-DA等化學計量學分析。應用SPSS19.0軟件(美國IBM公司)對差異物進行t-檢驗。應用Multi Experiment Viewer軟件(v 4.8.1)進行熱圖繪制。

圖1 HS-GC/MS和HS-SPME-GC/MS方法分析白肋煙中揮發性、半揮發性成分的總離子流圖

2 結果與討論

2.1 分析模式的選擇

HS和HS-SPME是測定揮發性成分的常用方法[23]。比較了HS和HS-SPME方法測定煙葉中揮發性、半揮發性成分的定性結果。結果表明,HS-SPME在測定煙葉揮發性、半揮發性成分種類方面具有明顯優勢(見圖1)。由于HS無富集作用、靈敏度低,測定的揮發性、半揮發性成分非常有限,僅測到乙醛、2-甲基丙醛、丙酮、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、乙酸、丙二醇、煙堿、新植二烯、1,2-二乙酸甘油酯、麥斯明和二烯煙堿,且響應值相對較低。與HS-SPME方法相比,HS方法在測定乙醛、2-甲基丙醛等低沸點(100 ℃以下)成分時有利,但不能測定巨豆三烯酮、紫羅蘭酮、5-羥甲基糠醛等高沸點的煙草特征香味成分,及吡啶、糠醛、丁內酯、苯乙酮等煙草中微量的香味成分。

2.2 固相微萃取條件的優化

2.2.1固相微萃取纖維頭的選擇

不同材質的萃取頭對不同化合物的萃取效率不同。在萃取溫度60 ℃,孵化時間8 min,萃取時間40 min, 250 ℃解吸3 min條件下,比較了85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、60 μm PEG和85 μm PA 5種不同纖維頭對煙粉中揮發性、半揮發性成分的萃取效果(見表1)。結果表明:85 μm CAR/PDMS可以得到104個峰,其中致香成分64種;50/30 μm DVB/CAR/PDMS可以得到91個峰,其中致香成分64種;65 μm PDMS/DVB可以得到110個峰,其中致香成分78種;60 μm PEG可以得到78個峰,其中致香成分42種;85 μm PA可以得到86個峰,其中致香成分60種。由于60 μm PEG和85 μm PA極性較強,得到的色譜峰數目和致香成分數均小于其他3種纖維頭,為了保證分析數據的全面性,不采用60 μm PEG和85 μm PA這兩種纖維頭。

表1 不同萃取纖維頭條件下得到的色譜峰個數和致香成分數

CAR: carboxen; PDMS: polydimethylsiloxane; DVB: divinylbenzene; PEG: polyethylene glycol; PA: polyacrylate.

除了分析化合物的豐富性,分析精密度也是評價纖維頭的一個主要因素。對85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB 3種纖維頭共有的86個色譜峰的分析精密度進行了比較,結果如表2所示。3種纖維頭中,50/30 μm DVB/CAR/PDMS的分析精密度最差,65 μm PDMS/DVB比85 μm CAR/PDMS的分析精密度更好,且測定的香味成分種類更多。因此選擇65 μm PDMS/DVB。

表2 不同纖維頭的分析精密度

RSD: relative standard deviation of the peak areas for a component in six repeated measurements using the same fiber.

2.2.2萃取溫度優化

在孵化時間為8 min、萃取時間為40 min、250 ℃解吸3 min條件下,分別考察了40、50、60、70和80 ℃時各色譜峰的相對峰面積。以5種不同極性、不同沸點的重要香味成分為例(下同),各色譜峰在不同溫度條件下的相對峰面積變化如圖2a所示。隨溫度升高,糠醛、茄酮相對峰面積依次升高;丙酸相對峰面積依次降低;苯酚、D-泛酰內酯相對峰面積先升高后降低。該結果可能與溫度的動力學和熱力學作用有關,溫度升高有利于揮發性、半揮發性成分進入頂空相,同時不利于纖維頭對揮發性、半揮發性成分的吸附。低沸點極性化合物在低溫下即可達到氣固平衡,而升高溫度將降低其在纖維頭上的吸附,因此響應出現下降趨勢。而升高溫度有利于高沸點化合物的揮發,響應升高[24]。為保證分析方法的全面性和靈敏度,選擇萃取溫度為60 ℃。

圖2 萃取溫度(a)、孵化時間(b)、萃取時間(c)和解吸時間(d)對白肋煙中5種重要成分相對峰面積的影響

2.2.3孵化時間的優化

在萃取前,需將樣品在一定溫度條件下孵化一段時間。在萃取溫度為60 ℃、萃取時間為40 min、250 ℃解吸3 min條件下,分別考察了孵化2、4、6、8和10 min時各色譜峰的相對峰面積,如圖2b所示。結果表明:隨孵化時間延長,各色譜峰相對峰面積略有增加;孵化8 min時,糠醛、D-泛酰內酯、苯酚相對峰面積增加,茄酮和丙酸相對峰面積下降。為保證分析方法的全面性和靈敏度,選擇孵化時間8 min。

2.2.4萃取時間的優化

在萃取溫度為60 ℃、孵化時間為8 min、250 ℃解析3 min條件下,分別考察了萃取10、20、30、40、50、60、70、80和90 min時各色譜峰的相對峰面積,如圖2c所示。隨萃取時間延長,糠醛、茄酮、丙酸的相對峰面積先上升后趨于穩定;苯酚和D-泛酰內酯相對峰面積先上升,40 min后下降。因此,萃取時間選擇40 min。

2.2.5解吸時間的優化

為保證各組分解吸完全,在孵化時間8 min、60 ℃萃取40 min、解吸溫度250 ℃條件下,分別考察了解吸時間1、2、3、4、5和6 min時各色譜峰的相對峰面積。結果如圖2d所示,解吸時間為3 min時,色譜峰相對峰面積趨于穩定。因此選擇解吸時間3 min。

2.3 實驗方法評價

2.3.1定性結果

取等量的烘焙前后煙粉樣品,充分混合得到質控(QC)樣品。采用建立的HS-SPME-GC/MS方法對QC樣品進行檢測。利用AMDIS對共流出色譜峰進行解析,單次分析檢測172個色譜峰。通過與標準品(79種吡啶類、吡嗪類、酸類、酯類、酮類、生物堿、醇類、烷烴)的保留時間和質譜圖嚴格對照,并運用美國國家標準與技術研究院(NIST)標準質譜庫進行檢索(反匹配度大于800),結合保留指數,初步定性了其中122種揮發性、半揮發性成分(見表3)。檢測到的揮發性、半揮發性成分主要是一些香味成分,包括吡啶類、吡嗪類、烯烴類、醛類、酮類、酯類、酸類、醇類、酚類等。

表3 白肋煙中鑒定到的揮發性、半揮發性成分

表3 (續)

Rt: retention time; RI: retention index; R.match: the matching degree of the actual mass spectrum to the standard mass spectrum in National Institute of Standards and Technology.* The compound was identified by comparing the retention time and mass spectrum with standard.The ions in bold were quantitative ions.

2.3.2方法精密度

在化學計量學分析中,目標物分析的精密度影響分析結果。連續5天,每天平行測定3個QC樣品,對實驗方法的精密度進行了考察。所有檢測峰的保留時間的相對偏差均在±0.04 min內,其保留時間的穩定性為自動積分提供了可能。檢測到的122種化合物中,93種化合物的相對峰面積的RSD在15%以內,占總峰個數的76%,占總峰面積的95%(見圖3)。

2.4 白肋煙烘焙前后揮發性、半揮發性成分的變化

2.4.1PCA分析

為初步了解不同批次烘焙入口與烘焙出口煙葉的相似性和差異性,采用無監督模式的PCA方法對2個批次白肋煙烘焙前后數據進行分析。在圖4的PCA得分圖中,第2批次烘焙前后白肋煙煙葉樣品在第一主成分(PC1)維度上區分明顯,PC1代表了樣本總體差異的42.6%,第1批次樣品烘焙前后差異不明顯,但可區分。兩批次白肋煙煙葉樣品在第二主成分(PC2)維度上區分明顯,PC2代表了樣本總體差異的27.1%。

圖3 不同化合物的日間相對標準偏差的分布

2.4.2PLS-DA分析

圖5 烘焙前后白肋煙煙葉的PLS-DA分析

圖4 烘焙前(A-1、A-2)、后(B-1、B-2)白肋煙煙葉主成分得分圖

為進一步了解白肋煙煙葉烘焙前后揮發性、半揮發性化學成分的差異,將烘焙入口樣品作為一組(B-1-1～B-1-6、B-2-1～B-2-6),烘焙出口樣品作為一組(A-1-1～A-1-6、A-2-1～A-2-6),建立PLS-DA模型。PLS-DA是一種有監督分析方法,用于建立類別間的數學模型,使各類樣品間達到最大的分離,并可根據變量重要性投影(VIP)值篩選差異化合物。圖5a的得分圖中,烘焙前后白肋煙煙葉在PC1維度上區分明顯,PC1代表了樣本總體差異的41.1%,且烘焙后的2批次樣品在PC2維度上區分明顯,PC2代表了樣本總體差異的18.6%。建立的PLS-DA模型2個主成分解釋了96.1%的Y變量差異,預測能力為94.6%,說明該模型具有較好的預測能力[25]。經過200次排列檢驗得到的R2、Q2截距分別為0.204和-0.333(見圖5b),R2截距小于0.4,Q2截距小于0.05,表明該模型穩定可靠,不存在過擬合。

圖6 烘焙前后白肋煙煙葉中揮發性、半揮發性化合物的熱圖

根據建立的PLS-DA模型的VIP值(閾值為1),初步篩選了32種對區分烘焙前后煙葉貢獻大的成分(見圖5c)。為更直觀地了解白肋煙烘焙前后化學成分的變化,采用32種化學成分對2批次烘焙前后白肋煙煙葉進行聚類分析,并繪制熱圖(見圖6)。結果表明:煙葉樣品按照烘焙前和烘焙后明顯聚為2大類,烘焙前和烘焙后煙葉又可分別按批次分為2小類,即烘焙前后煙葉可采用差異顯著的32種化學成分進行區分。對2個批次煙葉烘焙前后的32種成分分別進行t-檢驗,除3-乙酰基-1H-吡咯、1,3,7,7-四甲基-2-氧雜雙環[4.4.0]-5-葵烯-9-酮在第1批次烘焙前后煙葉間無顯著性差異,苯甲酸、乙基香蘭素和香蘭素在第2批次烘焙前后煙葉間無顯著性差異外,其余27種成分在2個批次煙葉樣品烘焙前后均存在顯著性差異(p<0.05)。烘焙后,2批次白肋煙煙葉中甘油、丙二醇、3-乙基-2-羥基-2-環戊烯-1-酮、2-乙酰基吡啶、三甲基吡嗪、異氟爾酮、茶香酮、薄荷醇、乙基吡嗪、2,5-二甲基吡啶、異戊酸、丁內酯、苯乙醇、2,3-丁二醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、2-甲基丁酸、2,3-二甲基吡嗪、γ-己內酯、2-甲基吡啶含量均顯著下降;6-乙基-5,6-二氫-2H-吡喃-2-酮、2-吡咯烷酮、吲哚、巴豆酸、3-乙基-4-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮、5-羥甲基糠醛、麥芽酚和二烯煙堿含量均顯著上升。

與烘焙前相比,烘焙后白肋煙煙葉中的大部分揮發性、半揮發性成分含量下降,主要與揮發有關,此過程也有利于除去2-乙酰基吡啶等不利于煙氣感官的物質[26]。另外,烘焙后部分吡咯類、酸類、呋喃類等煙草特征香味成分含量顯著上升。吡咯類具有咖啡、可可的香韻,可增加白肋煙煙香;吲哚為色氨酸的分解產物,具有梔子花的香氣;巴豆酸含量增高可能與長鏈脂肪酸的分解和焦糖化反應有關;5-羥甲基糠醛為重要的煙草致香物質,具有甜的花香,與碳水化合物的分解及美拉德反應有關[27,28]。麥芽酚可能為料液中成分,高溫烘焙有助于料液的吸收。綜上所述,高溫烘焙則有助于料液吸收,促進料液與煙葉化學成分發生焦糖化作用和美拉德反應產生香味物質,提高白肋煙煙葉的吸食品質。

3 結論

建立了HS-SPME-GC/MS測定煙葉中揮發性、半揮發性成分的方法。該方法樣品用量小、前處理簡單、靈敏度高,適用于煙葉中低含量的揮發性、半揮發性成分的測定。同時結合化學計量學方法分析了白肋煙烘焙前后化學成分的變化,為白肋煙烘焙條件的優化提供了科學的檢測方法。揮發性、半揮發性成分的非靶向分析方法可較為全面、系統地表征氣味物質,與化學計量學結合可直觀反映氣味物質的變化,篩查關鍵的風味物質基礎,在茶葉、面包等食品加工領域具有廣泛的應用推廣前景。