超高效合相色譜法對6種三唑類農藥對映體的拆分及其在黃瓜中的殘留分析

2019-11-07 01:03:26張文華侯建波陳欽可李淑敏祝澤龍鄒學權徐敦明

色譜 2019年12期

張文華, 謝文*, 侯建波, 陳欽可, 李淑敏, 祝澤龍, 鄒學權, 徐敦明

(1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院, 浙江杭州 310016; 2.浙江立德產品技術有限公司, 浙江杭州 310016; 3.廈門海關技術中心, 福建廈門 361026)

手性是自然界普遍存在的現象,隨著科學的發展,對光學純物質的需求量越來越大,手性對映體分離日益引起人們的關注。傳統的手性農藥研究,不區分對映體,將所有對映體視為同一物質來對待,GB 2763-2016《食品中農藥最大殘留限量》中只是規范了農藥的外消旋體使用安全標準,并未精確規定每種農藥的有功效且低毒性的對映體和無功效且高毒性的對映體殘留限量。然而,手性農藥的不同對映體在生物過程及環境介質中,往往存在著立體選擇性行為。如三唑醇有2個手性中心,因此有4個對映異構體,這4個光學異構體殺菌能力完全不同,左旋體的藥效高于右旋體,毒性還比右旋體低[1]。而GB 2763-2016規定茄果類蔬菜中三唑醇的最高殘留限量≤1.0 mg/kg,如果能進一步研究三唑醇的4種對映體在蔬菜水果中的殘留量,那將能為三唑醇對映體殘留分析提供精確的判定。

三唑類農藥作為一類高效殺菌劑,能有效保護水果、大豆、谷物等農作物免受細菌侵害,在農業生產中的應用非常廣泛[2]。該類化合物分子中均含有1個或2個手性中心,即存在2個或4個對映體結構。目前三唑類農藥手性分離主要是通過色譜方法實現的,如電泳(CE)[3-7]、氣相色譜法(GC)[8,9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-12]和超臨界流體色譜法(SFC)[1,13]等均有成功拆分的研究報道。對映體的物理化學性質相似,傳統手段拆分較為困難。所需拆分時間通常在30 min以上,可能需要幾根手性柱配合使用,有些對映體拆分效果不理想。近年來新推出的超高效合相色譜(UPC2)的流動相為壓縮二氧化碳,是一種介于氣體和液體之間的超臨界流體,流體黏度小,比HPLC中所使用的液體流動相擴散率更高、更有利于傳質。同時,所使用的手性色譜柱是基于亞2 μm粒徑填料的色譜柱,粒徑小,理論塔板數高,分離效率高。溫度和壓力的微小變化能引起UPC2流動相的密度和溶解能力的較大差異,通過精確地調節流動相強度、壓力和溫度獲得所需要的系統分辨率和選擇性,從而對待測物的保留和分離進行有效調控。這非常適合結構類似物、異構體以及對映體和非對映體的分離、檢測和定量[14-16]。目前,UPC2技術應用于三唑類農藥對映體的分離和相應對映體的殘留測定鮮有報道。

為了解決上述對映體拆分測定的難題,本文建立了一種超高效合相色譜法拆分三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、聯苯三唑醇、腈菌唑6種三唑類農藥對映體及測定其對映體在黃瓜基質中殘留量的方法。方法的回收率和精密度均符合殘留檢測的要求。對藥物的使用效果、殘留量判定和新藥開發有重要的指導意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效合相色譜儀(美國沃特世公司);臺式離心機(美國Thermo公司); R215旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司); AE260電子天平(瑞士Mettler公司); MS2渦旋混勻器(上海醫大儀器廠);超純水凈化系統(英國Elga公司);微孔過濾膜(0.22 μm,有機相);氮吹儀(日本東京理化公司)。

正己烷、丙酮、乙腈(色譜純,西班牙Scharlau公司);無水硫酸鈉(分析純,450 ℃灼燒,上海試四赫維化工有限公司);弗羅里硅土(Florisil)吸附劑(優級純,100～200目,國藥集團化學試劑有限公司,650 ℃灼燒24 h, 使用2%超純水滅活后備用);石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)和C18(優級純,上海安譜科學儀器有限公司);無水硫酸鎂(分析純,西隴科學股份有限公司); QuEChERS試劑(含有PSA 50 mg、C18 50 mg、GCB 7.5 mg、無水硫酸鎂150 mg);水為超純水;其他實驗所用試劑除特殊說明外均為分析純。

6種外消旋體:三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、聯苯三唑醇、腈菌唑(純度≥99%,德國Dr Ehrenstorfer 公司)。

16種對映體:(+)-S-三唑酮、(-)-R-三唑酮、(-)-(S,R)-三唑醇、(+)-(R,S)-三唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇、(+)-(R,R)-三唑醇、(+)-己唑醇、(-)-己唑醇、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-聯苯三唑醇-A、(+)-聯苯三唑醇-A、(-)-聯苯三唑醇-B、(+)-聯苯三唑醇-B、(+)-腈菌唑、(-)-腈菌唑(純度均大于95.0%,上海勤路生物技術有限公司)。

1.2 標準溶液及試劑配制

1.2.1外消旋體標準溶液

6種三唑類農藥儲備液(1.0 g/L):分別稱取0.01 g(精確至0.1 mg)上述三唑類農藥外消旋體標準品,用正庚烷分別溶解定容至10 mL, 4 ℃避光保存。

標準中間溶液:分別準確量取適量的三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、聯苯三唑醇、腈菌唑外消旋體標準儲備液,依次用正庚烷稀釋配制成6組20.0 mg/L的外消旋體標準溶液(用于后續外消旋體的拆分), 4 ℃避光保存。

1.2.2對映體標準溶液

16種三唑類農藥對映體儲備液(1.0 g/L):分別稱取0.01 g(精確至0.1 mg)上述三唑類農藥對映體標準品,用正庚烷分別溶解定容至10 mL, 4 ℃避光保存。

分別準確量取適量的對映體儲備液,依次用正庚烷稀釋配制成16種20.0 mg/L的對映體標準溶液(用于確定16種對映體的保留時間), 4 ℃避光保存。

標準中間溶液:分別準確量取幾種適量的對映體儲備液,混合,用正庚烷稀釋配制成100.0 mg/L的標準中間溶液,于4 ℃避光保存。標準中間溶液共4組,如下:A組包括(+)-S-三唑酮、(-)-R-三唑酮、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-聯苯三唑醇-A、(+)-聯苯三唑醇-A、(-)-聯苯三唑醇-B和(+)-聯苯三唑醇-B共8種對映體;B組包括(-)-(S,R)-三唑醇、(+)-(R,S)-三唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇、(+)-(R,R)-三唑醇共4種對映體;C組包括(+)-己唑醇和(-)-己唑醇2種對映體;D組包括(+)-腈菌唑和(-)-腈菌唑2種對映體。

標準工作溶液(用于黃瓜樣品殘留實驗分析):準確吸取一定量的標準中間溶液A、B、C、D,用乙腈分別稀釋至0、1.0、2.0、4.0、10 mg/L的標準工作溶液A、B、C、D, 4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

稱取試樣10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,均質提取,再加入3.0 g氯化鈉,渦旋混勻,4 000 r/min離心5 min后,移取上清液至盛有0.5 g石墨化炭黑的50 mL離心管中,渦旋1 min后,以8 500 r/min離心5 min,轉移上清液至濃縮瓶中,向剩余殘渣中再加入20 mL乙腈重復上述提取步驟,合并兩次提取液,用旋轉蒸發儀濃縮至近干,用50 mL丙酮-正己烷(1∶1, v/v)溶液復溶。

1.3.2凈化

將復溶液轉移至裝有10 g脫活弗羅里硅土玻璃管中(使用前已做過淋洗曲線),上樣后用濃縮瓶直接接收凈化液,用旋轉蒸發儀濃縮至近干,用1 mL乙腈定容,定容液用QuEChERS試劑凈化,15 000 r/min離心5 min后,經0.22 μm混合型濾膜過濾作為測定液。

1.4 色譜條件

色譜柱:Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料為改良的多糖型手性固定相,美國Waters公司);助溶劑:甲醇(三唑酮、三唑醇、戊唑醇、聯苯三唑醇),異丙醇-無水乙醇(1∶1, v/v)溶液(己唑醇、腈菌唑);動態備壓(ABPR): 17.2 MPa;流速:2.5 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:40 ℃;檢測波長:250 nm(聯苯三唑醇), 220 nm(其他5個化合物)。

1.2.2節中的4組對映體標準工作溶液A、B、C、D按照各自優化的色譜條件和未知樣品的定容液一起進樣測定。

2 結果與討論

除三唑醇和聯苯三唑醇有兩個手性中心、4個對映體外,其他4種農藥都只有1個手性中心、2個對映異構體。考慮到6種農藥結構上具有一定的相似性,本實驗嘗試用一根手性柱(Acquity Trefoil AMY1)在UPC2上拆分這6種農藥。

2.1 穩定性和定容液試劑的考察

將三唑類農藥溶解于正庚烷中,配成1.0 g/L標準品溶液,于-18 ℃下保存放置?？疾靹偱渲茣r所測得的農藥含量和分別儲存1、3、5、7、14、30、60天后的農藥含量。結果顯示,6種三唑類農藥外消旋體于-18 ℃下放置14天時含量變化均小于10%,放置30天時含量降低了13%～42%,放置60天時含量降低了20%～67%,說明6種三唑類農藥的外消旋體在14天內比較穩定(見圖1)。6種三唑類農藥對映體含量都是呈逐漸降低趨勢,其中三唑醇的一個對映體(-)-(S,S)-三唑醇和戊唑醇的一個對映體(-)-R-戊唑醇于-18 ℃下放置14天時含量降低了10%以上,而放置7天時含量變化小于10%,其他對映體于-18 ℃下放置14天時含量變化均小于10%,說明6種三唑類農藥的對映體在7天內比較穩定。

圖1 6種三唑類農藥外消旋體儲備液在正庚烷中60天內的穩定性考察

實驗前處理過程中樣品濃縮10倍,雜質含量很高,對凈化條件要求很高,因此實驗中除了經過自制弗羅里硅土柱凈化之外,定容液還要加QuEChERS試劑進行凈化。標準工作溶液和定容液采用正庚烷試劑溶解,實驗結果表明,定容液加QuEChERS試劑凈化后,三唑醇對映體幾乎被全部吸附,三唑酮的兩個對映體分別被吸附了74%和79%,戊唑醇、聯苯三唑醇和己唑醇的對映體分別被吸附了11%～36%,而采用乙腈試劑定容溶解,定容液加QuEChERS試劑凈化后,這6種三唑類對映體被吸附量均小于5%,說明目標化合物在乙腈環境下幾乎不會被吸附。雖然在正庚烷試劑中6種三唑類農藥的對映體峰形更好,但是為了避免目標化合物被QuEChERS試劑吸附,故最終標準工作溶液和定容液均采用乙腈試劑。同時,本實驗按照上述方法考察了6種三唑類農藥外消旋體和對映體的工作溶液在乙腈中的穩定性,結果表明,標準工作溶液在乙腈中可以保存7天。

2.2 色譜條件的優化

UPC2所采用的流動相是以二氧化碳超臨界流體為主體,配比不同有機溶劑作為助溶劑來調節流動相的極性和溶解性,有效改變目標物的峰形和保留時間,以獲得最佳的分離效果,常用的助溶劑通常為甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇等。在其他色譜條件不變的情況下,考察流動相分別選擇甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇為有機改性劑時對6種三唑類農藥手性分離的影響。結果顯示,以甲醇作為有機改性劑時,三唑酮、戊唑醇、聯苯三唑醇和三唑醇對映體均達到良好拆分,己唑醇和腈菌唑的對映體無法達到良好的分離。而以異丙醇-乙醇為有機改性劑時,己唑醇和腈菌唑對映體均達到良好拆分。因此,針對該6種三唑類農藥對映體的手性拆分,本實驗采用了兩種助溶劑,三唑酮、戊唑醇、聯苯三唑醇和三唑醇采用甲醇作為助溶劑,己唑醇和腈菌唑采用異丙醇-乙醇作為助溶劑。

超高效合相色譜中,動態背壓也是影響分離過程的重要因素之一,其主要作用是控制CO2在整個操作過程中處于超臨界流體狀態。在不同的動態背壓下,CO2超臨界流體對樣品有著不同的溶解能力。當背壓升高時,超臨界流體密度會增大,溶劑化能力增強,柱壓升高。本實驗以CO2和甲醇或異丙醇-乙醇為流動相,考察背壓在10.3～17.2 MPa范圍內時對樣品分離的影響。結果顯示,隨著動態背壓升高,分析物保留時間減少。綜合考慮保留時間、峰形及色譜柱壓力,實驗選擇動態背壓為17.2 MPa。

隨著色譜柱溫度的升高,目標物的保留時間逐漸延長,這與傳統超高效液相色譜是不相同的。這是因為色譜柱溫度越高,超臨界流體密度越小,溶劑化能力降低,超臨界流體對目標化合物的溶解及交換能力可能減弱,使得目標物的保留時間增大。本實驗在保持其他色譜條件不變的前提下,在30～45 ℃范圍內考察了柱溫對目標物分離的影響。結果顯示,三唑酮和己唑醇的最佳分離溫度為35 ℃,戊唑醇的最佳分離溫度為45 ℃,三唑醇、聯苯三唑醇和腈菌唑的最佳分離溫度為40 ℃,綜合考慮6種三唑類農藥16個對映體的分離效果及峰形,本實驗柱溫選擇40 ℃。

綜合比較了改性劑、動態背壓、溫度等影響因素,發現流動相中改性劑種類對6種三唑類農藥對映體的分離效果影響最大,因此,選擇適當改性劑及其配比是獲得對映體最佳分離效果的主要手段。16種三唑類農藥對映體標準溶液(1.2.2節中配制的20.0 mg/L)依次單獨進樣,按照上述優化的色譜條件分析,確定16種對映體的保留時間,并建立16種對映體標準品光譜庫。6種三唑類農藥外消旋體標準溶液(1.2.1節中配制的20.0 mg/L)依次單獨進樣,按照上述優化的色譜條件進行拆分,如圖2所示,6種三唑類農藥外消旋體的16個對映體均得到良好的分離。

圖2 6種三唑類農藥對映體的拆分色譜圖

2.3 提取試劑的優化

文獻報道中通常采用乙腈-丙酮[17]、丙酮-二氯甲烷[18]、丙酮-乙酸乙酯-正己烷[19]、乙腈[20,21]對三唑類農藥進行提取,本文考察了這4種試劑的提取效果,結果顯示用乙腈-丙酮或丙酮-乙酸乙酯-正己烷提取時,三唑酮、三唑醇、己唑醇和腈菌唑存在基質干擾峰;用丙酮-二氯甲烷提取時,6種三唑類農藥的色譜圖均存在基質干擾峰;而用乙腈作為提取試劑,6種三唑類農藥的色譜圖上的基質干擾峰較少,結果與文獻報道的相符[20,21]。此外乙腈也是我國目前農藥多殘留分析方法常用的提取溶劑[22],因此本方法選其作為提取溶劑。

2.4 凈化條件的優化

分別選用自制Florisil柱(10 g)、商品化Florisil柱(CNW, 5 g, 60 mL)、商品化Carb/NH2(艾杰爾,500 mg, 6 mL)3種固相萃取柱對黃瓜樣品提取溶液進行凈化試驗,外標法定量。在3份空白黃瓜樣品中分別添加0.1 mg/kg的三唑類農藥對映體,用乙腈均質提取2次,提取液經過GCB凈化,再分別采用3個不同固相萃取柱進行凈化,消除黃瓜本底對實驗結果的影響。實驗結果表明:3種固相萃取柱均能有效去除色素成分,用Carb/NH2復合柱凈化時,(-)-R-三唑酮、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇和(+)-腈菌唑存在基質干擾峰,無法進行準確定量測定。而采用商品化Florisil柱和自制Florisil柱凈化時,16個對映體的基質干擾較小,且平均回收率分別為85%和92%。Florisil柱需要加水脫活,自制Florisil柱比較容易控制弗羅里硅土的含水量,而商品化Florisil柱的弗羅里硅土是在包裝內,每個柱子內的弗羅里硅土含水量不同,從而導致活性不一致,在對有些活性要求高的化合物檢測時,樣品檢測的重現性較差。另外,市場上銷售的Florisil柱規格大多是1 g、2 g或5 g,而10 g規格的Florisil柱較少,而本實驗前處理過程中黃瓜樣品濃縮10倍,雜質含量很高,1 g、2 g或5 g規格的商品化Florisil柱的柱容量達不到凈化要求,因此必須使用10 g規格的Florisil柱。綜合考慮,最終采用自制10 g Florisil柱凈化黃瓜樣品提取液。

2.5 方法學考察

2.5.1方法的線性范圍和定量限

將16種三唑類農藥對映體儲備液用乙腈稀釋成0、1.0、2.0、4.0、10 mg/L的標準工作溶液。在建立的分析條件下對其進行測定,以峰面積(y)對質量濃度(x)做標準曲線。結果表明,16種三唑類農藥對映體在0～10 mg/L范圍均呈良好的線性關系,相關系數為0.999。當空白黃瓜中添加0.1 mg/kg的三唑類農藥對映體標準溶液時,信噪比大于10,因此方法的定量限(LOQ)被定為0.1 mg/kg,而歐盟、日本、國際食品法典委員會(CAC)規定該6種三唑類農藥在黃瓜中的限量為0.1～1 mg/kg。本方法的定量限完全能滿足黃瓜中三唑類農藥對映體的測定要求。

2.5.2回收率和精密度

分別在空白黃瓜中添加0.1、0.2、0.5 mg/kg 3種水平的三唑類農藥對映體進行方法學考察,按優化條件進行提取并分析,每個添加水平平行測定6次。如表1所示,6種三唑類農藥中16個對映體的加標回收率在65.1%～116%之間,相對標準偏差(RSD)為1.0%～9.6%。(+)-S-三唑酮、(+)-聯苯三唑醇-A、(-)-聯苯三唑醇-B、(+)-腈菌唑和(-)-腈菌唑的加標回收率符合SN/T 0001-2016[23]對回收率的要求,其他11個對映體的加標回收率不符合SN/T 0001-2016[23]對回收率的要求。雖然部分三唑類農藥對映體的加標回收率不符合SN/T 0001-2016[23]對回收率的要求,但其相對標準偏差小,重現性均較好。

2.6 實際樣品檢測

從當地超市、農貿市場上采購20批次黃瓜樣品,涵蓋本地產的大黃瓜和荷蘭小黃瓜兩個品種,利用所建立方法進行檢測。結果顯示,20批次黃瓜樣品均未檢出上述16種三唑類農藥對映體。

表16種三唑類農藥中16個對映體在黃瓜基質中的加標回收率及相對標準偏差(n=6)

Table1Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs)of16enantiomers of the six triazole pesticides in cucumber matrix(n=6)

PesticideenantiomerSpiked/(mg/kg)Recovery/%RSD/%(+)-S-Triadimefon0.181.3-92.86.60.286.9-93.84.20.587.8-98.25.7(-)-R-Triadimefon0.174.0-82.96.10.272.7-80.04.80.575.6-79.82.7(-)-(S,R)-Triadimenol0.176.6-85.25.60.274.7-89.49.40.574.4-78.62.8(+)-(R,S)-Triadimenol0.165.2-74.06.30.265.2-70.04.00.565.2-69.83.6(-)-(S,S)-Triadimenol0.169.8-83.09.30.269.1-79.87.40.571.0-80.06.4(+)-(R,R)-Triadime-nol0.168.5-79.37.60.271.6-78.44.60.571.6-75.22.5(+)-Hexaconazole0.196.0-1096.60.299.5-1167.90.595.6-1087.0(-)-Hexaconazole0.175.1-89.09.00.278.4-93.28.70.575.2-78.42.1(+)-S-Tebuconazole0.165.1-77.49.30.267.6-75.85.80.592.4-99.63.9(-)-R-Tebuconazole0.180.2-91.06.90.281.8-97.28.70.577.2-81.82.9(-)-Bitertanol-A0.173.4-87.59.60.275.8-88.37.60.575.8-79.42.4(+)-Bitertanol-A0.189.3-99.45.40.293.7-99.43.30.597.2-1053.8(-)-Bitertanol-B0.181.7-94.87.60.294.5-99.83.10.590.2-94.82.8(+)-Bitertanol-B0.175.5-84.85.80.279.6-95.59.40.575.8-79.62.6(+)-Myclobutanil0.192.9-1045.80.294.4-1045.30.598.4-1043.2(-)-Myclobutanil0.182.4-90.45.00.289.2-98.04.70.587.4-89.21.0