聚[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱固相萃取結合高效液相色譜法測定尿液中3種苯二氮類藥物

杜 梨, 李 娜, 劉美琨, 王翰云, 張倩影, 王曼曼*, 王學生*

(1.華北理工大學公共衛生學院, 河北 唐山 063210; 2.華北理工大學附屬醫院, 河北 唐山 063000)

在儀器分析之前,由于尿液成分復雜且BZDs含量低,需要采用液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)等技術進行富集凈化。SPE是利用固體吸附劑吸附液體樣品中的目標化合物,然后選擇性洗脫,而達到富集凈化復雜基質中目標化合物的一種前處理技術[9]。吸附劑作為其核心,決定了分析方法的時間、成本和準確度。目前主要使用親水-親脂平衡柱、離子交換柱和C8/C18柱等商品化固相萃取柱[10,11]對尿液中BZDs進行前處理。基于吸附劑在分析過程中的重要作用,新型高效吸附劑的開發成為研究熱點。

有機聚合物整體柱是通過單體、致孔劑、交聯劑和引發劑等混合物的原位聚合得到的連續棒狀材料,具有制備簡單、性質穩定和結構多孔等特性[12]。與填充型吸附劑相比,它避免了裝填過程,使用時其多孔結構易于傳質,提高了萃取效率,因而被廣泛用于樣品前處理領域[13]。李娜等[14]使用聚(乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱對血清中卡馬西平和10-羥基卡馬西平進行前處理,結合高效液相色譜分析,檢出限為0.004 μg/mL和0.01 μg/mL,回收率為92.7%和94.2%。Yang等[15]采用聚(乙烯基苯硼酸-N,N-亞甲基雙丙烯酰胺)整體柱結合高效液相色譜對尿液中4種單胺類神經遞質進行富集,富集因子高于17,檢出限為0.06～0.08 μg/L,回收率為81.0%～105.5%。

本研究以[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(DAC)為單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯劑在注射器模具中制備聚(DAC-co-EDMA)整體柱,結合HPLC,建立簡單、高效的尿液樣品中3種BZDs的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1260型高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD,美國Agilent公司); Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡(日本日立公司); FTIR-8400S傅里葉紅外光譜儀(日本島津公司)。

80%(質量分數)DAC水溶液、乙酸乙酯(ethyl acetate,色譜純)和EDMA(純度98%)(上海阿拉丁試劑公司);甲醇(methanol, MeOH)和乙腈(acetonitrile, ACN)(色譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司);醋酸銨(NH4Ac)、正丙醇、聚乙二醇400和偶氮二異丁腈(純度99%,天津市光復精細化工研究所);丙酮(acetone,唐山市路北區化工廠);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司); ProElut C18固相萃取柱(60 mg/3 mL,北京迪馬科技發展公司);一次性聚乙烯無菌注射器(2 mL,江西豐臨醫用器械有限公司)。

標準品:溴西泮(bromazepam, BRZ,純度99.9%)、勞拉西泮(lorazepam, LRZ,純度99.9%)和地西泮(diazepam, DZP,純度99.9%)的甲醇標準溶液(1 mg/mL)均購自美國Cerilliant公司,其結構式見圖1。

圖1 3種苯二氮類藥物的化學結構式

1.2 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的制備

圖2為聚(DAC-co-EDMA)整體柱的合成示意圖。量取35 μL DAC、500 μL EDMA、1 mL正丙醇、500 μL聚乙二醇400和50 μL H2O，混合均勻后,加入8 mg偶氮二異丁腈,超聲混合均勻。取500 μL該溶液灌入一端封口的2 mL注射器中,密封后于55 ℃水浴條件下反應4 h。反應結束后使用MeOH沖洗,得到聚(DAC-co-EDMA)整體柱。

圖2 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的合成示意圖

1.3 尿液樣品的采集和制備

采集4例口服1 mg LRZ患者9 h[16]后的尿液樣品,使用H2O稀釋(尿液∶H2O=3∶1, v/v)后[8],以1 500 r/min離心10 min,收集上清液。采集若干名未服用BZDs的健康志愿者尿液作為對照樣品,處理方法同上。本實驗經華北理工大學醫學倫理委員會批準。

1.4 固相萃取

使用MeOH和H2O各2 mL，平衡聚(DAC-co-EDMA)整體柱,上樣4 mL尿液樣品,加壓使其以1 mL/min的流速流出,用4 mL H2O沖洗, 1 mL乙酸乙酯洗脫,將收集的洗脫液于35 ℃、34 kPa條件下氮吹濃縮至干,使用MeOH復溶至0.2 mL,過濾,進行HPLC分析。

1.5 HPLC條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫35 ℃;流動相為(A)H2O和(B)MeOH;流速為1 mL/min。梯度洗脫程序為0～5.0 min, 62%B; 5.0～13.0 min, 62%B～80%B。進樣量:20 μL;檢測波長:228 nm。

圖3 (a)聚EDMA整體柱、聚(DAC-co-EDMA)整體柱的紅外光譜圖和(b)聚(DAC-co-EDMA)整體柱的掃描電鏡圖(×5000)

2 結果與討論

2.1 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的構筑和表征

圖3a為聚EDMA和聚(DAC-co-EDMA)整體柱的紅外光譜圖,與聚EDMA整體柱相比,聚(DAC-co-EDMA)整體柱在1 456 cm-1和950 cm-1處出現的吸收峰為銨甲基C-H彎曲振動峰和季銨基團C-N伸縮振動峰,在1 732 cm-1和2 881 cm-1處出現的吸收峰為C=O伸縮振動峰和=C-H伸縮振動峰[17],說明DAC與EDMA成功聚合。將聚(DAC-co-EDMA)整體柱進行掃描電鏡表征,圖3b表明該柱具有均勻的孔結構,作為吸附劑使用時,有利于降低物質的傳質阻力,并提高吸附效率。

實驗選擇BZDs為探針目標物。固定反應溫度為55 ℃,考察聚合時間為2、3、4和5 h構筑的整體柱對3種BZDs吸附性能的影響(見圖4)。隨著聚合時間的延長,3種BZDs的吸附效率逐漸提高,當反應時間增加到4 h時,吸附效率達100%,繼續增加聚合時間至5 h后,3種BZDs的吸附效率無明顯變化,因此實驗最終選擇整體柱的聚合時間為4 h。

圖4 聚合時間對3種苯二氮類藥物吸附效率的影響(n=3)

實驗同時考察聚EDMA整體柱對3種BZDs的吸附效率,在相同吸附條件下,聚EDMA整體柱對BRZ、LRZ和DZP的吸附效率分別為39.0%、26.3%和92.8%,而聚(DAC-co-EDMA)整體柱對3種BZDs的吸附效率均達100%。聚EDMA柱床具有疏水性[18],對脂水分配系數(logP)在2.2～4.0范圍內的3種BZDs藥物具有一定的吸附作用。當引入DAC單體后,整體柱柱床增加的銨基提供了離子交換基團,對于pKa在1.3～3.3范圍內的3種BZDs而言，吸附作用顯著提高至100%。

以吸附效率的相對標準偏差(RSD)評價同一批次(n=3)和不同批次(n=3)制備的聚(DAC-co-EDMA)整體柱的重復性,批次內和批次間的RSD分別為1.7%～2.8%和3.0%～7.6%。該整體柱重復使用15次,以3種BZDs的吸附效率計算RSD,結果均≤8.9%。以上結果表明,該柱制備簡單,用時短,吸附效率高且重復性良好。

2.2 固相萃取條件的優化

固相萃取的淋洗和洗脫步驟決定了該方法的準確度。實驗固定上樣體積為4 mL,上樣含量為50 ng/mL,考察淋洗溶液和洗脫溶劑種類對3種BZDs回收率的影響。

圖5 (a)淋洗溶液和(b)洗脫溶劑對3種BZDs回收率的影響(n=3)

2.2.1淋洗溶液種類

淋洗的目的是保留目標物的同時最大限度地去除雜質,因此淋洗液的選擇至關重要。以健康志愿者尿液樣品分析,固定淋洗溶液體積為4 mL,洗脫溶劑為1 mL乙酸乙酯,考察了H2O、ACN-H2O(5∶95, v/v)、NH4Ac溶液(25 mmol/L, pH=5)和0.9%(質量分數)NaCl水溶液的淋洗效果。以上4種淋洗液對雜質的去除率均達到90%以上,但當使用H2O作為淋洗液時,3種BZDs的回收率最高(見圖5a)。因此實驗選擇H2O作為淋洗溶液。

2.2.2洗脫溶劑的種類和體積

洗脫條件決定了方法的準確度,實驗固定淋洗溶液為4 mL H2O,洗脫體積為1 mL,考察4種洗脫溶劑(丙酮、ACN、MeOH和乙酸乙酯)對目標物的洗脫效果。當洗脫溶劑為乙酸乙酯時,3種BZDs的洗脫效果最佳,回收率為97.3%～105%(見圖5b);繼續增加洗脫體積,會延長氮吹濃縮的時間。因此,實驗最終選擇1 mL乙酸乙酯進行洗脫。

2.3 聚(DAC-co-EDMA)整體柱的富集凈化效果

為了評價聚(DAC-co-EDMA)整體柱對尿液中BZDs的富集凈化效果,對BZDs標準溶液(750 ng/mL)(見圖6a)和加標50 ng/mL尿液樣品進行分析。如圖6b所示,尿液樣品直接進樣分析時,雜質的信號超過2 500 mAU, 3種BZDs的響應信號低,無法定量。當經過聚(DAC-co-EDMA)整體柱富集和凈化后(見圖6c),雜質的信號明顯降低,各目標物均得到有效富集,富集倍數為12～15倍,回收率為86.9%～102%。將尿液樣品經商品化C18固相萃取柱前處理(見圖6d), 3種BZDs的回收率為68.1%～114%,并且雜質響應信號明顯高于聚(DAC-co-EDMA)整體柱的凈化結果。說明聚(DAC-co-EDMA)整體柱凈化效果更佳。

圖6 (a)BZDs標準溶液(750 ng/mL)以及加標尿液樣品(50 ng/mL)(b)直接進樣、(c)經本方法處理和(d)經C18固相萃取柱處理的色譜圖

表1 3種BZDs的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限、定量限、回收率和精密度

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

2.4 方法驗證

2.4.1線性范圍、檢出限和定量限

在最佳實驗條件下,在4.0～1 000 ng/mL范圍內配制一系列3種BZDs的標準溶液(n=7)進行分析,以目標物的質量濃度(x, ng/mL)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標,構建標準曲線(見表1)。結果表明,3種BZDs在4.0～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好,相關系數(r)為0.999。

對健康志愿者的尿液樣品分析,按信噪比(S/N)=3和S/N=10分別計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結果分別為1.0～1.2 ng/mL和3.3～4.0 ng/mL。

2.4.2回收率和精密度

為了驗證該方法的準確度和精密度,以健康志愿者的尿液為樣品,加標10、25和50 ng/mL 3個水平進行分析(n=3)。如表1所示,3種BZDs的回收率為81.4%～102%,日內和日間精密度(n=3)分別為1.2%～4.5%和2.5%～8.3%。表明該方法準確可靠。

2.5 實際樣品分析

為了進一步驗證方法的可行性,使用聚(DAC-co-EDMA)整體柱,結合HPLC測定4例服用LRZ患者的尿液樣品。在4例患者的尿液樣品中均檢出了LRZ,含量為(72.1±1.6)～(85.2±3.2) ng/mL,加標回收率(加標水平為50 ng/mL)為78.2%～98.3%, RSD≤5.0%。

3 結論

本研究制備了聚(DAC-co-EDMA)整體柱,并結合HPLC建立了檢測尿液中3種BZDs的方法。方法線性范圍寬,靈敏度和回收率高。該整體柱制備簡單,富集凈化能力高效,為尿液中BZDs的臨床檢測提供了一種新方法。