高效液相色譜-熒光法測定多囊卵巢綜合征患者血漿中吲哚類物質

韓潤川, 班艷娜, 甄乾娜, 周 瑩, 張曉清, 丁 敏*

(1.重慶醫科大學檢驗醫學院, 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室, 重慶 400016; 2.重慶醫科大學附屬第一醫院生殖健康與不孕癥專科, 重慶 400016; 3.重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科, 重慶 400016)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是常見于育齡期女性的內分泌系統疾病,發病率在育齡期婦女中高達10%[1]。PCOS患者易發生糖代謝紊亂,患2型糖尿病的風險是健康人的5～10倍。30%～35%的PCOS患者會出現糖耐量受損,65%～70%的患者伴發胰島素抵抗[2,3]。而機體糖代謝紊亂,尤其是胰島素水平升高,會促進血液中雄激素水平升高,使PCOS患者發生卵巢功能障礙[4,5]。目前,PCOS的診斷主要依據稀發排卵或無排卵、高雄激素血癥及卵巢多囊性改變。但高雄激素血癥并不是確診PCOS的必備條件,有15%～20%的PCOS患者未見雄激素升高,并且在確診PCOS時,還需排除非典型性腎上腺皮質增生、柯興綜合征、分泌雄激素的卵巢腫瘤等引起雄激素升高的疾病[6]。因此,需要尋找PCOS新的實驗室診斷標志物。

吲哚丙酸(indolyl-3-propionic acid, IPA)、吲哚乙酸(indolyl-3-acetic acid, IAA)、吲哚(indole, IND)與3-甲基吲哚(3-methylindole, 3-MI)是色氨酸在腸道菌群作用下的代謝產物,即細菌代謝物[7,8]。吲哚類物質,作為腸道菌群和人體細胞間重要的信號分子[9],通過體內的氧化應激,腸道炎癥反應和激素分泌等途徑參與人體生理功能調節[10]。IND可刺激腸道細胞調節胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide 1, GLP-1)的釋放[11], GLP-1是一種葡萄糖濃度依賴的具有降糖作用的腸源性激素,可以提高機體對葡萄糖的敏感性[12]。IPA是IND的細菌代謝產物,可以保護胰島細胞,促進胰島素的釋放,被認為是2型糖尿病的保護性因子[13]。吲哚類物質調節機體的糖代謝功能,而糖代謝紊亂是PCOS的特征性癥狀及發病誘因[14]。但目前尚無研究報道吲哚類物質在PCOS中的作用。因此,檢測PCOS患者血漿中吲哚類物質,不僅有助于闡明腸道菌群與PCOS的關系,也為尋找PCOS新的診斷標志物和治療靶點提供方向。

目前,血漿吲哚類物質的檢測方法主要采用高效液相色譜-熒光法和超高效液相色譜-質譜法[15,16]。同時檢測人血漿中IPA、IAA、IND和3-MI等吲哚類物質的方法尚未見報道。本研究建立一種快速、靈敏的高效液相色譜-熒光法用于人血漿吲哚類物質(IAA、IPA、IND和3-MI)的同時檢測,并采用所建方法測定PCOS患者與健康育齡期女性血漿中吲哚類物質,以闡明其在PCOS患者中的變化,并探究吲哚類物質在PCOS中的潛在診斷價值。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1100 LC型高效液相色譜儀(配有G123型熒光檢測器); Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm); Milli-Q超純水過濾裝置(美國Millipore公司); HIMAC-15低溫臺式離心機、SAVANT ISS110真空離心濃縮儀(美國Thermo公司); SB-3200超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司); ZWY-100H恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造公司); GM-0.33隔膜真空泵(天津津騰有限公司)。

IPA、IAA、IND和3-MI標準品(純度99.9%,美國Sigma公司);甲奈酚標準品(純度99.0%,北京百靈威科技有限公司);甲醇(色譜純,美國Tedia公司)。

分別稱取一定量的IPA、IAA、IND、3-MI和甲奈酚標準品,用流動相(15 mmol/L磷酸二氫鈉溶液-甲醇(42∶58, v/v)分別配制IAA(0.2 mol/L)、IPA(0.1 mol/L)、IND(0.1 mol/L)、3-MI(0.1 mol/L)和甲萘酚(5.0 g/L)標準儲備液,分裝保存于-20 ℃。使用前用流動相稀釋至所需濃度。

1.2 實驗條件

1.2.1樣本采集及預處理

患者61例,均經過病史詢問、性激素測定與超聲檢查,確診為PCOS患者。同時選擇健康育齡期女性25例作為對照組,兩組樣本均來自重慶醫科大學第一附屬醫院。本研究獲得重慶醫科大學倫理委員會的批準和受試者的知情同意。抽取受檢者空腹靜脈血2 mL,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,低速離心后取血漿于-20 ℃保存。

取血漿300 μL,加入10 μL 5 mg/L甲萘酚溶液(內標)和600 μL乙醚,渦旋混勻后,在搖速為250 r/min的搖床作用下振蕩18 min,于4 ℃以13 300 g離心5 min,取上清液,真空離心旋干后,加入90 μL 15 mmol/L磷酸二氫鈉溶液-甲醇(42∶58, v/v)復溶,渦旋5 min,取上清液50 μL進樣分析。

1.2.2HPLC條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm);柱溫:30 ℃;流動相:15 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 4.6)-甲醇(42∶58, v/v);流速:0.8 mL/min;進樣量:50 μL。熒光檢測波長程序設置:0～6.00 min,激發波長(λex)和發射波長(λem)分別為282 nm和352 nm; 6.01～9.00 min,λex和λem分別為274 nm和340 nm; 9.01～14.00 min,λex和λem分別為282 nm和352 nm。

1.2.3統計學分析

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

本實驗的待測物IAA、IPA、IND和3-MI以及選取的內標都具有自然熒光,為了提高方法的靈敏度,通過Agilent 1100 LC色譜工作站分別對各待測物進行熒光光譜掃描,根據各待測物最佳檢測波長,設置程序化熒光檢測波長。

2.2 樣本預處理方法的確定

為了減少基質干擾對色譜分析的影響,本實驗分別考察了蛋白質沉淀和液-液萃取法兩種預處理方法(見圖1)。與甲醇蛋白質沉淀法比較,采用乙醚進行液-液萃取血漿樣本,內源性物質干擾較小。因此,本實驗選擇乙醚進行液-液萃取,以實現對血漿中的目標化合物的凈化與富集。

圖1 血漿經不同方法預處理后的色譜圖

2.3 色譜條件的確定與優化

本實驗選擇甲醇和磷酸鹽緩沖溶液作為流動相,對流動相中甲醇的體積分數、緩沖液pH值及柱溫進行了考察。

以血漿為樣本進行分析,甲醇體積分數為55%～60%時,隨著甲醇體積分數的增大,各分析物的保留時間縮短,分離度(R)逐漸減小,而甲醇體積分數為60%時,內標與內源性物質的分離度小于2.0;而甲醇體積分數為55%時,保留時間較長。故選擇流動相中甲醇體積分數為58%。

通過氫氧化鈉調節15 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液的pH值，考察其對分離效果的影響(見圖2)。pH值為3.8時,IPA與IND不能有效分離(R<2.0); pH值為5.4與6.5時,IPA與IAA不能有效分離(R<1.5);而pH值為4.6時,各組分均能實現有效分離。故流動相中磷酸鹽緩沖液的pH值選擇為4.6。

考察了柱溫對分析效果的影響。當柱溫為25 ℃時,保留時間較長;柱溫為35 ℃時,3-MI的分離度減小;而柱溫為30 ℃時,能在較短時間內實現各組分的有效分離。因此,實驗將柱溫設置為30 ℃。

圖2 不同pH值條件下血漿樣本的色譜圖

2.4 方法學評價

2.4.1標準曲線及檢出限

配制IAA、IPA、IND和3-MI系列濃度標準溶液,加標至健康人混合血漿樣本中,經過樣本預處理后檢測。以血漿加入待測物的濃度為橫坐標,血漿中待測物峰面積與內標峰面積的比值減去空白血漿中待測物峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標,繪制標準曲線;以信噪比(S/N)=3計算檢出限,結果見表1。

表1 血漿中IAA、IPA、IND和3-MI的回歸方程、相關系數(r)、線性范圍和檢出限

y: ratio of peak-area of the analytes to IS subtract the ratio of peak area of pooled plasma to IS;x: concentration of the analytes, nmol/L.

選取健康人血漿(低濃度組)和PCOS患者血漿(高濃度組),日內重復測定5次,連續測定5 d,以進行日內與日間精密度考察,結果見表2。相對標準偏差均≤6.31%,表明該方法精密度良好。

2.4.2回收率

分別添加高、中、低3種濃度的15 μL IAA、IPA、IND和3-MI混合標準溶液至285 μL健康人混合血漿樣本中,進行加標回收試驗,結果見表3。IAA、IPA、IND和3-MI的平均回收率為97.5%～107.0%,表明方法準確可靠。

表2 血漿吲哚類物質的精密度(n=5)

表3 血漿中吲哚類物質的加標回收率(n=3)

2.4.3干擾試驗

溶血、脂血、黃疸是血漿樣本臨床檢測中常見的干擾因素[17]。溶血標本會將細胞內容物混入血漿,從而影響血漿樣本的檢測[18],而黃疸與乳糜顆粒會干擾檢測器的光譜分析,影響檢測結果[19]。因此需要明確干擾物質濃度對檢測結果的影響。

按照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)制定的標準。用甲醇將膽紅素、膽固醇及甘油三酯凍干粉標準品溶解,配制標準溶液。取健康人混合血漿285 μL,加入15 μL不同濃度的膽紅素標準溶液,經樣本預處理后檢測。分別測定加入膽紅素前的血漿待測物濃度(XC)和加入后的待測物濃度(XT),若干擾值(XT-XC)在95%置信區間內,則說明膽紅素對檢測結果無顯著干擾。結果表明,血漿膽紅素濃度≤36.5 μmol/L時對測定結果無影響。采用同樣的方法考察血漿中甘油三酯和膽固醇對檢測方法的干擾,結果顯示,甘油三酯濃度≥2.9 mmol/L、總膽固醇濃度≥16.6 mmol/L時,對檢測有影響。因此在檢測實際樣本時,出現黃疸和脂血現象可能會影響檢測結果。

取健康人EDTA抗凝全血分成兩份,一份在4 ℃、2 000 g離心力下離心,分離血漿;另一份在-20 ℃與室溫間反復凍融直至全部溶血,均用生理鹽水配制不同程度的溶血標本。一部分樣本用于血紅蛋白的檢測,另一部分樣本經預處理后檢測。結果顯示,溶血標本血紅蛋白含量≤35 g/L時對測定無影響,故在檢測實際樣本時應避免溶血。

2.4.4穩定性考察

將血漿樣本于-20 ℃凍存0、5、10和30 d,在常溫下解凍,經樣本預處理后測定,計算各待測物的濃度,以及濃度的RSD。結果表明,各待測物RSD均小于日間RSD,表明血漿樣本在-20 ℃下至少可保存30 d。

2.5 臨床應用

2.5.1吲哚類物質含量的測定

用所建立的方法分別測定正常對照組(n=25)與PCOS患者組(n=61)血漿吲哚類物質濃度,結果見表4。結果顯示:與對照組比較,PCOS患者血漿的IAA、IPA、IND和3-MI明顯升高,且具有統計學意義(P<0.05)。

表4 PCOS組和對照組血漿中IAA、IPA、IND和3-MI的濃度

P: the statistical significance was assessed using Student’st-test.

2.5.2血漿吲哚類物質診斷PCOS

本實驗用ROC曲線分別評價血漿吲哚類物質對PCOS的診斷效能并尋找最優診斷閾值, ROC曲線圖見圖3。其中,IND的診斷效能最好,ROC曲線下面積(AUC)為0.900,靈敏度和特異度分別為82.0%和88.0%。結果表明,IND對PCOS具有良好的診斷價值。

圖3 血漿吲哚類物質診斷PCOS的ROC曲線

2.5.3PCOS危險因素分析

對PCOS組和對照組中4種吲哚類物質進行Logistic回歸分析,優勢比(odds ratio, OR)是反映吲哚類物質與PCOS關系的指標。當OR>1時,表示其與疾病發生呈正相關。結果顯示,IND是PCOS發生的危險因素(OR=1.228, 95%置信區間:1.125～1.341,P<0.001)。

3 結論

本研究建立了同時檢測血漿中的IAA、IPA、IND和3-MI吲哚類物質的高效液相色譜-熒光法。本方法采用等度洗脫,分析時間短,靈敏度高,樣本用量少,適用于臨床與科研。該方法成功應用于分析PCOS患者和正常育齡期女性體內吲哚類物質的濃度。