高效液相色譜-串聯質譜法測定酵素食品中的匹可硫酸鈉

何嘉雯, 溫家欣, 賴宇紅, 劉亞雄, 曹雅靜, 陳 俏

(廣東省藥品檢驗所, 廣東 廣州 510180)

酵素及酵素食品來自日本天然健康的食品概念,國內引用其調節新陳代謝的功能,宣稱酵素食品具有通便減肥的功效[1,2]。網絡上酵素食品主要有果凍、糖果、蜜餞和飲料等,經發展已成為新興的暢銷減肥產品。由于市場利潤巨大,減肥類非法添加藥物層出不窮[3-10]。2019年初,本實驗室對宣稱通便減肥的酵素食品進行風險監測,檢出一種減肥類非添新成分,經確證為“匹可硫酸鈉”。

匹可硫酸鈉(sodium picosulfate)CAS號10040-45-6,別名匹克硫酸鈉,相對分子質量481.41,分子式C18H13NNa2O8S2,結構式見圖1,白色或幾乎白色結晶粉末,無嗅無味,易溶于水、微溶于甲醇[11,12]。匹可硫酸鈉是一種緩瀉藥,可用于各種形態的便秘,不良反應包括惡心、下痢、腸胃道反應等[13,14]。匹可硫酸鈉及其制劑已在歐美、日本批準使用,復方匹可硫酸鈉顆粒于2018年10月在國內獲批,歸屬化學藥物管理。我國食品添加劑目錄、新資源食品名單均未收入匹可硫酸鈉,因此不能作為食品原料使用。匹可硫酸鈉在國內認知程度較低,有可能成為新型的減肥類非法添加藥物。

圖1 匹可硫酸鈉分子結構圖

目前,減肥類非法添加藥物的檢測研究較多[3-10],以液相色譜-質譜聯用法為主流,檢測成分已達幾十種,但均未包含匹可硫酸鈉。關于果凍、軟糖、蜜餞基質的研究較少,而食品中匹可硫酸鈉的檢測方法基本處于空白。減肥類藥物多為脂溶性成分,前處理基本采用甲醇[4-10]、乙腈[3]對樣品進行簡單提取。匹可硫酸鈉為鈉鹽,水溶性極佳,脂溶性差,采用有機溶劑提取高蛋白基質時會被包埋而影響提取。本實驗室曾以文獻方法[3,10]測定奶昔中的匹可硫酸鈉,回收率低于20%,不符合定量要求。另一方面,針對片劑、膠囊劑的前處理方法不適用于果凍、軟糖。匹可硫酸鈉在果凍、軟糖中的添加過程,可能是配成水溶液與溫熱的果凍液、糖液混合,再冷卻成型,因此匹可硫酸鈉可分散于食品內部。樣品的有效溶散是提取關鍵,而有機溶劑對樣品中的食用膠有變性作用[15,16],不利于溶散過程。因此,檢測高蛋白、膠質型酵素食品中匹可硫酸鈉,必須建立新的前處理方法。

本實驗室對市場上酵素食品的摸查結果表明,近四成產品檢出匹可硫酸鈉,非法添加情況十分嚴峻。本文針對匹可硫酸鈉,開發了一種適用于果凍、軟糖、蜜餞、固體飲料等酵素食品的檢測方法,彌補當前檢測方法的空白,為監管提供技術支撐手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20ADXR高效液相色譜儀(日本島津公司); Triple Quad 5500三重四極桿串聯質譜儀(配ESI)(美國Sciex公司);渦旋振蕩器(德國IKA公司);恒溫水浴箱(德國Julabo公司);超聲提取器(昆山市超聲儀器有限公司);固相萃取裝置(美瑞泰克科技有限公司);超純水機(美國Millipore公司)

匹可硫酸鈉標準品(純度96%,加拿大TRC公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Holly公司);乙酸銨、氨水(含量25%～28%)、無水乙醇、三氯乙酸(分析純,廣州化學試劑廠);聚酰胺柱(1 000 mg/6 mL,美國Thermo公司)。氨水-70%乙醇混合溶液:量取100 mL氨水與900 mL 70%(v/v)乙醇水溶液混勻。1%三氯乙酸溶液:稱取10 g三氯乙酸溶于1 000 mL水中。

152批次酵素食品收集于風險監測任務、飛行檢查和科研網購。提取考察實驗用樣品采用陰性樣配制,均一化稱量后,果凍、軟糖高溫熔融時加入少量標液,放冷備用;蜜餞、固體飲料加入少量標液,放置半小時后備用。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg匹可硫酸鈉標準品,用水配成1 000 mg/L的標準儲備液,4 ℃下保存3個月。準確量取適量標準儲備液,用水配成5 mg/L的標準使用液,4 ℃下保存2周。取適量標準使用液,用水配成匹可硫酸鈉質量濃度為5～500 μg/L的標準曲線溶液,臨用新配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

取適量樣品,采用搗碎、剪碎、研磨等方式充分粉碎或混合均勻后備用。

果凍、軟糖:準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入40 mL水,80 ℃下水浴至樣品溶解,取出放冷至室溫,轉移至50 mL容量瓶,用5 mL水洗滌離心管,洗滌液并入同一容量瓶,加入5 mL 1%三氯乙酸溶液,用水定容至50 mL,待凈化。

蜜餞:準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入40 mL水,超聲提取20 min,提取液和殘渣轉移至50 mL比色管,用5 mL水洗滌離心管,洗滌液并入同一比色管,加入5 mL 1%三氯乙酸溶液,用水定容至50 mL,待凈化。

固體飲料:準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入25 mL水,渦旋分散,80 ℃下水浴10 min,取出放冷至室溫,8 000 r/min下離心5 min,上清液轉移至50 mL容量瓶。加入20 mL水重復提取一次,合并兩次上清液。于上清液中加入5 mL 1%三氯乙酸溶液,用水定容至50 mL,待凈化。

若上述待凈化液渾濁,可取適量在8 000 r/min下離心5 min,取上清液備用。

1.3.2凈化

用10 mL水預先活化聚酰胺柱。取10 mL待凈化液于柱內,待凈化液流盡后,依次用10 mL水、10 mL 70%(v/v)甲醇水溶液洗滌,15 mL氨水-70%乙醇混合溶液洗脫,收集洗脫液于80 ℃下水浴蒸發至近干,用水定容至5 mL,過0.22 μm微孔濾膜,待測。若匹可硫酸鈉濃度超出線性范圍,可用水適當稀釋。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱:Thermo Accucore RP-MS(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm,美國Thermo公司);流速:0.3 mL/min,乙腈-10 mmol/L乙酸銨(15∶85, v/v)等度洗脫。柱溫35 ℃,進樣量5 μL。

采用ESI源,正離子掃描,多反應監測(MRM)模式檢測;電噴霧電壓5 500 V,離子源溫度550 ℃;霧化氣壓力:3.447×105Pa,氣簾氣壓力2.759×105Pa,碰撞氣壓力6.207×104Pa。匹可硫酸鈉采集參數:定量離子對m/z438.2/183.9,去簇電壓(DP)120 V,碰撞能(CE)40 V;定性離子對m/z438.2/278.2, DP 120 V, CE 28 V。

2 結果與討論

2.1 匹可硫酸鈉的確證

匹可硫酸鈉為新發現的非法添加成分,需進行確證實驗。采用Q Exactive高分辨質譜(美國Thermo公司)采集有證標準品和可疑樣品中匹可硫酸鈉色譜峰的質譜信息。色譜圖中,可疑樣品檢出與標準品保留時間一致的色譜峰;一級質譜圖中,正離子模式下標準品母離子精確質量數為438.030 15,樣品為438.030 18,兩者質量偏差小于0.000 05;在二級圖譜中有3個相同的碎片離子。上述結果表明,兩者為同一物質,檢出成分確證為匹可硫酸鈉。

圖2 不同提取方法對各基質中匹可硫酸鈉的提取效果

2.2 提取條件的優化

2.2.1提取溶劑和提取方式

匹可硫酸鈉水溶性極好,宜采用水或與水混溶的溶劑提取,選取水、甲醇和乙腈進行比對。參考果凍、蜜餞、固體飲料常用的提取方式[15-17],選擇水浴和超聲進行比較。提取溶劑與提取方式相互組合,形成6種方式,考察對應的提取效果,結果見圖2。結果表明:(1)采用水-水浴提取時,4種基質的回收率均大于98%; (2)含有乙腈的組合對各種基質提取均不理想;(3)甲醇對軟糖的提取較差;(4)果凍、軟糖、固體飲料采用水浴提取優于超聲,蜜餞兩者提取的效果相當。分析原因,甲醇、乙腈使軟糖變性、固體飲料結塊,導致目標物包埋,不利于提取。常溫下軟糖、果凍溶解不完全,含淀粉、奶精的固體飲料呈稀糊狀,不利于目標物分散。進一步優化發現,蜜餞在提取時已充分剪碎,被水浸泡存在吸水發脹問題,超聲較水浴的發脹程度小,所以蜜餞更適于采用超聲提取。

80 ℃是溶解果凍、軟糖常用的溫度。在該溫度下,果凍、軟糖在水中溶散,水稀釋了樣品中食用膠的濃度,即使恢復至常溫亦不會再次成膠[15,16]。上文制得的果凍、軟糖和固體飲料提取液在80 ℃下水浴1小時,考察匹可硫酸鈉的熱穩定性。對于質量濃度為100 μg/L的加標提取液,水浴前后測得的峰面積比值為0.98～1.03,可以認為匹可硫酸鈉溶液在80 ℃下加熱1 h仍穩定。

綜上,果凍、軟糖、固體飲料采用水-水浴提取,蜜餞采用水-超聲提取。

2.2.2蛋白沉淀劑的選擇

奶昔、代餐等固體飲料含大量蛋白,需加入沉淀劑除去。參考乳制品常用的蛋白沉淀劑[18-20],考察亞鐵氰化鉀-乙酸鋅、乙腈和三氯乙酸的效果。加入沉淀劑后,回收率依次為61%、19%和98%,三氯乙酸最佳。進一步考察,三氯乙酸有調節溶液酸度的作用。各基質提取液pH為2～7,加入一定量三氯乙酸溶液后,pH值穩定在2～3,有利于后續凈化。因此,在提取液中加入三氯乙酸可起到沉淀蛋白和穩定提取液pH值的作用。

2.3 凈化條件的優化

2.3.1吸附條件的優化

果凍、軟糖的膠質和蜜餞的鹽會在分析過程中堵塞色譜柱,污染質譜,影響結果的準確性,必須進行凈化。提取液為水溶液,采用固相萃取較合適,選擇HLB、MCX、聚酰胺(PA)進行考察。設定的吸附量參考收集到的陽性樣品中含量的最高值。當樣品中匹可硫酸鈉的含量為4 000 mg/kg,取樣1 g、稀釋倍數50、上樣量為10 mL時,吸附總量為800 μg。MCX吸附率約34%, HLB和PA吸附率約100%。但HLB對目標物和雜質的吸附能力相當,30%(v/v)甲醇水溶液淋洗時會發生共流出。PA對目標物和雜質的吸附有差異,在70%(v/v)甲醇水溶液淋洗下雜質被洗出而匹可硫酸鈉仍被保留。因此,選擇PA作為吸附劑。

2.3.2洗脫條件的優化

匹可硫酸鈉利用磺酸基,通過氫鍵與聚酰胺結合,在酸性和中性下暴露的磺酸基有利于吸附,堿性時氫鍵被破壞從而被洗脫,這是提取液pH 2～3有利于吸附的原因。依次用10 mL的水、30%(v/v,下同)甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液等溶劑進行洗脫。結果表明,上述中性溶液均不影響PA對匹可硫酸鈉的吸附,隨甲醇體積比的升高,洗脫雜質的能力增強。因此,選擇水洗去水溶性雜質,70%甲醇水溶液洗去有機雜質。

當淋洗溶劑為堿性時,PA對匹可硫酸鈉解吸附,依次用不同體積比(1∶99、5∶95、10∶90和20∶80)的氨水-70%乙醇混合溶液進行解吸,洗脫體積分別為5、10、15和20 mL時的洗脫效果見圖3。結果表明,當洗脫體積為15 mL時,各溶液回收率均達到80%。氨水-70%乙醇混合溶液(10∶90, v/v)的回收率為97%,滿足實驗要求。若洗脫液中氨水和乙醇的比例大,則直接測定時有明顯的溶劑效應,應蒸發除去后用水復溶,獲得潔凈的樣品溶液。

需要注意,尼龍是聚酰胺纖維,不可使用尼龍濾膜過濾樣品溶液。經考察,聚醚砜(PES)和聚四氟乙烯(PTFE)不吸附目標物,均可使用。一般情況下,PES適用于水溶液,PTFE適用于水溶液和有機溶液。

圖3 不同洗脫液組成和用量對匹可硫酸鈉的洗脫效果

2.3.3色素的干擾考察

果凍、軟糖、蜜餞中使用的人工合成著色劑被本方法提取,但不能在凈化過程中除去,需考察色素共存的影響。在加標提取液中加入檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍等常用色素,結果表明,1.0 g/kg色素共存時,匹可硫酸鈉回收率達98%,不受影響。

2.4 色譜-質譜條件的優化

美國藥典[12]采用乙腈-磷酸鹽緩沖液體系測定匹可硫酸鈉原料藥,此條件在液相色譜-質譜上不適用,緩沖鹽用10 mmol/L乙酸銨替代。更換緩沖鹽后,色譜峰略有拖尾,但隨C18色譜柱填料粒徑的減小,柱效的提高使峰形大有改善。因此,采用100 mm×2.1 mm規格的亞三色譜柱,乙腈-10 mmol/L乙酸銨作為流動相。

文獻[21]采用正離子模式檢測匹可硫酸鈉及其代謝物,因此在正離子模式下優化質譜條件。用蠕動泵以5 μL/min的流速連續注射100 μg/L的匹可硫酸鈉標準溶液于ESI源中,進行一級、二級質譜掃描,二級圖譜見圖4。選擇響應強度高、基線噪音低的m/z438.2/183.9、438.2/278.2為監測離子對,并在MRM模式下優化離子對的去簇電壓、碰撞能等參數。

圖4 匹可硫酸鈉的二級質譜圖

2.5 溶劑效應

采用常用的有機溶劑甲醇、乙醇和乙腈,以有機相體積分數為0%、10%、20%、30%、40%、50%、70%和100%的混合水溶液,分別配制100 μg/L匹可硫酸鈉標準溶液,考察溶劑效應。實驗結果表明,當有機溶劑在30%或以下時,匹可硫酸鈉的響應值無明顯差異;當有機溶劑高于30%時,隨其體積分數的增加,響應值明顯下降。因此,上機溶劑的有機相需控制在30%以下,采用水配制標準溶液最佳。

2.6 基質效應

基質效應由基質中共提取物干擾和目標化合物競爭電離所致。為評價基質效應,本研究使用4種基質的空白基質溶液配制質量濃度為5～500 μg/L的系列溶液,對質量濃度與峰面積進行線性回歸,將回歸方程斜率代入公式(基質效應=(1-溶劑標準曲線的斜率/基質匹配標準曲線的斜率)×100%)計算基質效應,負值表示基質抑制,正值表示基質增強,絕對值越大則效應越強[22]。果凍、軟糖、蜜餞和固體飲料的基質效應依次為-7.8%、-4.0%、-9.8%和-8.7%,屬于較弱的基質抑制,可不采取手段進行校正。

2.7 方法學考察

2.7.1線性范圍、線性方程和檢出限

用水分別配制質量濃度為5、10、50、100、250、500 μg/L的系列標準溶液,以峰面積(y)對質量濃度(x, μg/L)進行線性回歸,回歸方程為y=2 696.01x+1 994.60,相關系數(r)為0.999 9。結果表明匹可硫酸鈉在5～500 μg/L內呈良好的線性關系。

向陰性樣品中添加不同水平的標準溶液,按取樣1 g,稀釋25倍計算,信噪比(S/N)≥3時,匹可硫酸鈉質量濃度為2 μg/L,方法檢出限為0.05 mg/kg;信噪比S/N≥10時,匹可硫酸鈉質量濃度為5 μg/L,方法定量限為0.125 mg/kg,可滿足非法添加檢驗的要求。

2.7.2回收率和精密度

糖果、軟糖、蜜餞和固體飲料4種基質差異較大,均需進行考察。在各基質中進行1倍、2倍、10倍定量限3個水平的加標回收試驗,每個水平平行測試6次(n=6),結果見表1。匹可硫酸鈉在各基質中的回收率為89.2%～111.8%,相對平均偏差(RSDs)為2.5%～10.4%,結果良好。

表1匹可硫酸鈉在各基質中的加標回收率和精密度(n=6)

Table1Spiked recoveries and RSDs of sodium picosulfate in different matrices(n=6)

MatrixSpiked/(mg/kg)Recovery/%RSD/%Jelly0.12597.78.30.2598.02.61.25111.82.5Gelcandy0.12591.68.60.25108.110.41.2599.59.7Preservedfruit0.125107.37.50.25107.53.21.25103.23.8Beveragepowder0.12589.25.60.2591.14.01.2594.25.1

2.8 實際樣品測定

按本方法測定酵素食品152批次,在58批次樣品中檢出匹可硫酸鈉,陽性率為38.2%,具體檢出情況見表2。匹可硫酸鈉標準溶液及典型樣品提取定量離子流色譜圖見圖5。匹可硫酸鈉在果凍、軟糖、蜜餞和固體飲料中均有檢出,除去少數含量極低的樣品,各基質中檢出含量的最低值和最高值相差4～20倍,含量波動較大,安全風險較高。

表2 匹可硫酸鈉在各基質的檢出批次數和檢出含量

圖5 匹可硫酸鈉標準溶液及典型樣品提取定量離子流色譜圖

3 結論

本文建立了高效液相色譜-串聯質譜測定酵素食品中匹可硫酸鈉的方法。目標物采用水作為提取溶劑,經水浴或超聲提取,聚酰胺凈化。方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度滿足非法添加檢測要求,特別適合果凍、軟糖、蜜餞和固體飲料基質酵素食品中匹可硫酸鈉的定性、定量分析,靈敏度高、抗干擾能力強,準確可靠。該方法能彌補現時酵素食品中匹可硫酸鈉的檢測空白,有一定的實用意義。