經(jīng)典名方三痹湯中龍膽苦苷含量測定方法研究

但宇超，曾琪，馬安獻，張惠芹，季宗念，嚴啟新

（海王百草堂藥業(yè)有限公司，河南濮陽 457000）

三痹湯（San Bi Tang），來源于《婦人大全良方》卷三[1]。組方為黃芪、續(xù)斷、人參、茯苓、甘草、當歸、川芎、白芍、生地黃、杜仲、川牛膝、桂心、細辛、秦艽、川獨活、防風、生姜以及大棗。三痹湯是一種袪風之劑，其功能是益氣活血、補腎散寒、祛風除濕，用于筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、日晡潮熱[2]、小兒疳積發(fā)熱，主要有效成分為龍膽苦苷[3]。本實驗建立了龍膽苦苷的測定方法，為三痹湯的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

1260infinityⅡ安捷倫高效液相色譜儀（openlabcds色譜工作站）；Inetsil-ODS C18色譜柱[4]（4.6 mm×250mm，5.0 μm；填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠；安捷倫公司）；METLERTOLED分析天平（十萬分之一）；超聲清洗儀。

1.2 試劑

對照品龍膽苦苷，購于中國食品藥品檢定研究院（批號20180114），純度大于98%；甲醇、乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水。[5]

2 檢測方法的建立

2.1 標準溶液的制備[6]

精密稱取各對照品適量，加50%甲醇制成混合對照品溶液，質(zhì)量濃度為20.00μg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

取提取物粉末約1.000g，精密稱定，加入50%乙醇溶液50.00mL，超聲（功率250W，頻率40kHz）提取30min，冷卻，再次稱量，用50%乙醇溶液補足減失的量，搖勻，過濾，取濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

采用Inetsil-ODS C18（4.6mm×250mm，5 μm）色譜柱，柱溫25℃，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液[7]，梯度洗脫（見表1），流速1mL/min，檢測波長250nm，進樣量10μL，洗脫時間60min。

表1 梯度洗脫設置

2.4 精密度考察

精密吸取同一份三痹湯供試品溶液10μL連續(xù)進樣6次，以龍膽苦苷為參照峰，計算保留時間RSD和相對峰面積RSD均小于2%，相似度均大于0.99，表明該方法重復性良好，見表2、表3。

表2 龍膽苦苷日內(nèi)精密度

表3 龍膽苦苷日間精密度

2.5 重現(xiàn)性考察

取同一個批次三痹湯樣品6份，按照2供試品溶液制備方法制備三痹湯供試品溶液，每份3個平行，按照2.3中色譜條件分別進樣，記錄峰面積，其RSD范圍在1.23%～2.14%，表明方法重復性良好。見表4。

2.6 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一份供試品溶液，按2.3中色譜條件，分別在0、1、2、4、8、12、24、48 h和72h進樣10 μL，記錄色譜圖，以龍膽苦苷為參照峰，計算得保留時間RSD和相對峰面積RSD均小于2%，相似度均大于0.99，表明供試品溶液72h內(nèi)穩(wěn)定，見表5。

表4 重現(xiàn)性考察

表5 穩(wěn)定性考察

2.7 三痹湯中主要成分龍膽苦苷的含量測定

2.7.1 系統(tǒng)適應性試驗

混合對照品和提取物供試品溶液按照2.3中色譜條件分析，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000。混合對照品和供試品溶液色譜圖如圖1、圖2所示。

2.7.2 線性范圍考察

將以上制造的混合對照品，稀釋成系列不同梯度濃度的對照品溶液，按照3中色譜條件依次注入液相色譜儀測定峰面積，以峰面積和濃度進行線性回歸。結(jié)果見表6。

圖2 供試品溶液色譜圖

表6 龍膽苦苷濃度與峰面積線性表

線性回歸方程為：y=27.739x+0.2649，R=0.999，符合要求。

2.7.3 回收率試驗

取重復性試驗同批樣品，分別按照近似0.8∶1、1∶1、1.2∶1添加龍膽苦苷對照品，加入樣品中，按照2.2進行樣品制備，按照2.3中色譜條件進行分析測定，計算平均回收率為98.4%～101.5%，RSD在1.23%～2.02%，表明方法回收率良好，見表7。

表7 龍膽苦苷回收率

2.7.4 檢測限與定量限

龍膽苦苷的儀器檢測限為0.005483 μg/mL，定量限為0.01845 μg/mL。

2.7.5 樣品含量測定

精密吸取2.2中供試品溶液，按2.3中色譜條件進行測定，得到龍膽苦苷化合物峰面積，以外標法計算含量，結(jié)果見表8。

表8 含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

該方法建立了對三痹湯中的龍膽苦苷含量測定方法，通過方法學驗證表明，該方法的精密度、穩(wěn)定性和回收率等均符合要求，可以用于三痹湯質(zhì)量龍膽苦苷的控制環(huán)節(jié)。