ST懸浮細胞系的馴化與豬細小病毒的培養

趙 剛，閆 冰，劉鑫瑩

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞及病毒

ST細胞（哈藥集團生物疫苗有限公司保存和提供）；病毒（由哈藥集團生物疫苗有限公司制備、鑒定和保存）。

1.1.2 試驗試劑

新生牛血請（購自內蒙古金源康生物工程有限公司）；MEM 培養基（購自美國Gibco 公司）；Virus Pro?ST-S無血清培養基（購自上海源培生物科技有限公司）；胰蛋白酶（購自美國Sigma 公司）；0.5%豚鼠紅細胞懸液（哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心配制）。

1.2 試驗方法

1.2.1 ST細胞低濃度血清適應及馴化

采用逐步降低血清的方法馴化ST 細胞以適應低濃度血清培養，在含10%新生牛血清的MEM 培養液中穩定生長的ST 細胞長至對數生長中期時，更換為含5%新生牛血清的MEM培養液，待細胞長至80%～90%的匯合度時，胰蛋白酶消化細胞，以細胞密度為2.0×105個·mL-1傳代于含5%新生牛血清的MEM培養液中。經過5代后，ST細胞在含5%新生牛血清的MEM 培養液中的存活率維持在95%以上，并保持正常貼壁性能和較快生長速率，可進一步降低血清馴化培養。以同樣的方法使ST 細胞逐步適應含1%新生牛血清的MEM培養條件。

1.2.2 懸浮生長ST-S細胞株篩選

以適應1%新生牛血清條件的ST細胞為出發點，在三角培養瓶中進行懸浮培養馴化適應，培養液為1%新生牛血清的ST-S無血清培養基，細胞初始接種密度為5.0×105個·mL-1，培養轉速為160 r·min-1。每天取樣檢測細胞密度，從中選出生長旺盛的細胞擴繁保種，命名為ST-S細胞株。

1.2.3 病毒含量測定

將病毒液用MEM 細胞培養液作10 倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-73個稀釋度，各加入96孔細胞培養板，每個稀釋度6 孔，每孔100 μL，同設6孔加100 μL MEM作為無病毒空白對照。每孔加入100 μL新消化的ST細胞懸液（4.0×105個·mL-1），置37 ℃，5%CO2培養箱中培養5 d，每日觀察和記錄各孔中病毒感染情況，取最高細胞病變時間點，按Reed-Muench法，計算病毒的致半數細胞感染滴度（TCID50）。

1.2.4 生物反應器培養豬細小病毒

將ST-S 細胞以初始密度0.75×106個·mL-1接種至生物反應器，上罐后培養12h，按照MOI（病毒感染復數）0.1的比例接種豬細小病毒L株，接種后72 h 收獲。于7 L 生物反應器中連續培養3 批，測定豬細小病毒L株的病毒含量和紅細胞凝集價。

2 試驗結果

2.1 ST細胞低濃度血清適應及馴化

經低血清被動懸浮培養適應，ST 細胞呈現出細胞懸浮生長的形態，細胞個體大小基本均一，但細胞結團現象嚴重，個別細胞團較大。在低血清懸浮培養馴化后期，懸浮ST-S 細胞呈現較好的單細胞懸浮生長狀態，細胞呈圓球形，結團現象較少，胞體大小基本一致，生長速度正常，說明ST-S 細胞已經適應了低血清營養條件，成為單細胞懸浮狀態生長，見圖1、2。ST-S細胞不同時間細胞生長密度見表1。

由表1可知，ST-S細胞最高生長密度可達4.5×106個·mL-1。將該懸浮馴化好的ST-S細胞擴大培養確定為F0代。

2.2 懸浮ST-S細胞增殖豬細小病毒

將ST-S 細胞以初始密度0.75×106個·mL-1接種至生物反應器，上罐后培養12h，按照MOI（病毒感染復數）0.1的比例接種豬細小病毒L株，接種后72 h 收獲。于7 L 生物反應器中連續培養3 批，測定豬細小病毒L株的病毒含量和紅細胞凝集價。結果表明，工藝參數穩定性較好，病毒含量可穩定在107.36～107.60TCID50·mL-1，紅細胞凝集價在1∶512～1 024，結果見表2。

圖2 ST-S細胞懸浮培養后期

表1 ST-S細胞不同時間細胞生長密度

表2 懸浮ST-S細胞增殖豬細小病毒

3 討 論

試驗中采用逐步降低血清含量并調整無血清培養基配方的方法，最終可獲得無血清懸浮培養的ST細胞，此株ST細胞可以穩定連續傳代，細胞生長可以維持在較高的活力及細胞密度，從搖瓶放大至7L 反應器，細胞生長穩定。本研究掌握了一種ST 懸浮細胞馴化的方法，其他貼壁細胞的馴化也可借鑒此類方法。

經懸浮馴化的ST-S 細胞對豬細小病毒敏感，病毒在其上的增殖能力與轉瓶培養相當，可獲得較高的病毒滴度及紅細胞血凝價；轉瓶培養豬細小病毒的操作過程繁瑣、同一批次不同細胞瓶中病毒的滴度也存在差異、時間成本大。利用ST 懸浮細胞生產的病毒產量遠遠高于貼壁培養，且同一批次的病毒質量更均一穩定，為后續逐級放大奠定基礎。

4 結 論

本文所述方法馴化的ST 懸浮細胞呈現較好的單細胞懸浮生長狀態，生長速度正常，細胞最高生長密度可達4.5×106個·mL-1，以此為基礎制備豬細小病毒可規?；焖俅罅可a，易于質量控制，純度高，穩定性好，病毒含量可穩定在107.36～107.60TCID50·mL-1，紅細胞凝集價在1∶512～1 024。因此生產工藝可用于豬細小病毒的大規模生產。