Trx-2在急性壞死性胰腺炎大鼠脊髓組織的表達(dá)及褪黑素對(duì)其的影響

黃滟添 鐘衛(wèi)一（通訊作者） 梁志海 唐國(guó)都

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西 南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西 南寧 530021）

急性壞死性胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)。Trx-2是存在于細(xì)胞線粒體一種氧化還原蛋白，Trx-2在防止線粒體氧化應(yīng)激方面具有重要作用[1，2]。本文通過(guò)應(yīng)用外源性褪黑素干預(yù)ANP大鼠，觀察脊髓組織Trx-2和Trx-2mRNA的表達(dá)及脊髓組織病理、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，探討Trx-2在ANP的表達(dá)與及褪黑索對(duì)脊髓組織保護(hù)作用的機(jī)制。

1.材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠72只，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～250g（由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；左旋精氨基酸（Sigma公司）；褪黑素（Sigma公司）；RNAsimpleTolalRNAKit（Tiangen公司）；RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas公司）；SYBRPremixExTaqTM（TaKaRa公司）.兔抗鼠多抗（北京生物合成及生物技術(shù)公司）

1.2 方法

1.2.1 分組及造模

72只大鼠按隨機(jī)表法分成ANP組（A組）、褪黑素組（M組）和對(duì)照組（C組），每組24只.模型建立：各組大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h.自由飲水；A組和M組腹腔注射6%左旋精氨基酸25mL/kg體質(zhì)量3次，誘發(fā)ANP；M組在首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射0.25%褪黑素20mL／kg體質(zhì)量，而A組首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射生理鹽水20mL／kg體質(zhì)量；C組則腹腔注射等容積生理鹽水。末次腹腔注射后6、12、24h按時(shí)點(diǎn)處死大鼠.留取動(dòng)脈血，胰腺和頸段脊髓組織標(biāo)本.

1.2.2 胰腺和脊髓病理學(xué)檢查

胰腺和脊髓組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片及HE染色.光鏡下觀察大鼠胰腺和脊髓病理，胰腺病理參考Kusske等[3]的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分.

1.2.3 脊髓組織MDA、MPO和血清MDA的測(cè)定

制備脊髓組織勻漿和血清標(biāo)本，采用微量MDA試劑盒和MPO試劑盒（南京建成生物工程研究所），操作按說(shuō)明書。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)脊髓組織Trx-2表達(dá)

采用Elivison二步法檢測(cè)脊髓組織Trx-2表達(dá)。兔抗鼠多抗工作濃度1：200；生物素化羊抗兔二抗來(lái)自即用型免疫組化Elivisionplus廣譜試劑盒。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知表達(dá)Trx-2的乳腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。應(yīng)用Leica圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量灰度掃描，求出給定面積內(nèi)的灰度值。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)脊髓組織Trx-2mRNA的表達(dá)

取脊髓組織各約50mg，用RNAsimpleTolalRNAKit提取總RNA，以RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBRPremixExTaqTM熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增目的片段.據(jù)GenBank中的基因序列自行設(shè)計(jì)引物，Trx-2mRNA引物，Sense：5'TGGGCTTCCCTCACCTCTAC3'，Anti-Sense：5'GCTGTTTGGCTACCATCTTC3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度253bp ；β-actin引物，Sense：5'CCCATCTATGAGGGTTACGC3'，Anti-Sense：5'TTTAATGTCACGCACGATTTC3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度150bp.反應(yīng)條件為：94℃30s；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃2min最后融解曲線分析從56℃起，每增0.5℃進(jìn)行讀板，直到94℃.每次擴(kuò)增設(shè)無(wú)cDNA的陰性對(duì)照.在I-CyclerIQ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）上擴(kuò)增并分析結(jié)果（樣品的Trx-2mRNA表達(dá)值=Trx-2mRNA起始拷貝數(shù)/β-actin起始拷貝數(shù)）.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 胰腺組織病理分值（表1）

2.2 脊髓組織病理

C組脊髓大體未見(jiàn)明顯異常，光鏡下脊髓神經(jīng)元胞體豐滿，與周圍組織連接緊密，胞膜無(wú)皺縮，細(xì)胞漿、細(xì)胞核染色正常.A組脊髓大體見(jiàn)輕度腫脹，光鏡下部分脊髓神經(jīng)元胞體脹大，細(xì)胞均質(zhì)濃染，脊髓組織少數(shù)區(qū)域溶解，形成空白區(qū)，炎細(xì)胞侵潤(rùn)明顯，24時(shí)點(diǎn)明顯。M組大體改變同C組，鏡下脊髓組織損傷輕，僅部分神經(jīng)元神經(jīng)元胞體稍脹大，少量炎細(xì)胞侵潤(rùn)。

2.3 大鼠脊髓組織MDA、MPO和血清MDA、Trx-2等各項(xiàng)指標(biāo)的變化（表1）。

表1 3組大鼠脊髓組織MDA、MPO和血清MDA的變化各項(xiàng)指標(biāo)的比較（mean±SD）

3.討論

Trx是一個(gè)廣泛分布的氧化還原蛋白，通過(guò)其活性中心可逆地催化許多氧化還原反應(yīng)，參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)的Trx有多種，最為重要的是Trx-1和Trx-2。Trx-1是一種內(nèi)生抗氧化物，在胞質(zhì)通過(guò)直接清除活性氧而發(fā)揮抗氧化作用，在胞核通過(guò)抑制ikB-α的磷酸化，遏制NF-kB的活化，減少致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮間接抗炎、抗氧化作用[5]。Ritz等[6]認(rèn)為，Trx-2可相當(dāng)于Trx-1，在氧化應(yīng)激條件下，可以作為一個(gè)備份系統(tǒng)。最近研究揭示，線粒體在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Trx-2在參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑和防止線粒體氧化應(yīng)激方面，比Trx-1更具重要作用[2]。

褪黑素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)氧化應(yīng)激的器官具有保護(hù)作用。褪黑素分子能跨越任何形態(tài)的屏障進(jìn)入任何細(xì)胞而不受特定細(xì)胞間的分布限制。褪黑素能減輕多種物質(zhì)誘導(dǎo)的多種組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺組織的Trx-2mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，外源性給予褪黑素干預(yù)可胰腺和脊髓組織提高胰腺組織的抗氧化能力，減輕胰腺和脊髓組織的損傷，Trx-2在氧化應(yīng)激條件下，作為一個(gè)備份系統(tǒng)，Trx-2mRNA的表達(dá)水平因此而降低。