片仔癀調控膜聯蛋白A1/VEGF通路對人肝癌細胞系HepG2作用的影響

賴文芳，黃 鑫，劉俊杰，唐宇恒，林 昱，林 雅，林國清

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122; 2. 福建中醫藥大學附屬人民醫院傳統內科，福建 福州 350004)

片仔癀(Pien Tze Huang，PZH)是我國的傳統名貴中成藥，具有悠久歷史，配方及其制備工藝已被國家保密，該復方為國家一級中藥保護品種，由麝香、牛黃、蛇膽、三七等名貴中藥組成。常用于熱毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、癰疽疔瘡、無名腫毒及各種炎癥，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效[1-2]。近年來，越來越多關于片仔癀對肝病的作用機制研究，鄭海音等[3]研究發現，片仔癀對CCl4所致肝纖維化大鼠具有保護作用，其機制與抑制NF-κB的表達有關；陳志亮等[4]研究發現，復方片仔癀肝寶一定程度上能夠改善酒精性肝損傷的肝功能并能夠通過抑制酒精引起的SREBP2和HMGCRa蛋白表達的升高，從而起到保護肝臟的作用；同時也有研究發現片仔癀對肝細胞性肝癌患者，可緩解疼痛、縮小瘤體、抑制腫瘤轉移；能明顯提高毒熱瘀結型肝癌患者血液NK、CD4、CD4/CD8含量，改善患者經肝動脈化療栓塞所致的免疫抑制，增強機體免疫功能而產生一定抗肝癌作用。

膜聯蛋白 A1(annexin A1，ANXA1)是結構相關鈣依賴的磷脂結合蛋白超家族成員之一，參與調控炎性反應、細胞凋亡、細胞分泌和信號傳導等進程[5]，ANXA1 是重要的炎性調控蛋白，能夠參與炎性反應；且ANXA1表達的增加與NF-κB活性增強關系密切，NF-κB是一組具特殊DNA結合序列的轉錄因子[6]，諸多研究發現其能夠控制細胞增殖和癌變，且可促進腫瘤的侵襲轉移。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是分子量在40 000～45 000的同源二聚體糖蛋白，在腫瘤細胞和相鄰免疫細胞中，以自分泌或旁分泌的方式影響著早期腫瘤血管的發生發展過程[7]。有研究表明，VEGF在腫瘤的發生發展過程中起到促進新生血管生成的作用[8]，同時為腫瘤細胞生長提供必需的氧氣和營養物質[9-10]。

本文以ANXA1及其下游VEGF/VEGF受體、NF-κB信號通路為機制研究的切入點，通過研究片仔癀對人肝癌細胞HepG2的作用，從細胞水平闡明片仔癀抑制肝癌侵襲轉移的作用機制，為其臨床應用提供了理論基礎，也為研究中藥復方多靶點、多途徑產生藥效的機制提供一定借鑒。

1 材料

1.1 實驗細胞人肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 藥品與試劑片仔癀(漳州片仔癀藥業股份有限公司生產，規格：每粒重3 g，批號：0908035)；胎牛血清(HyClone，貨號：SV 30087.02)；β-Actin 抗體(碧云天生物技術有限公司，貨號：AA128)；PCNA抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#13110)；Bax抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#5023)；Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#15071)；cleaved caspase-3抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#9661)；cleaved caspase-9抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#20750)；ANXA1抗體(Abcam，貨號：ab97485)；VEGF抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#2463)；VEGFR抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#9698)；NF-κB p50抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#3035)；總RNA提取試劑盒(QIAGEN，貨號：74104、74106)；cDNA逆轉錄試劑盒(Fermentas，貨號：K1622)；TaqMan? Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號：R11022)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018)。

1.3 實驗儀器熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號：7900HT)；多功能酶標儀(TECAN，型號：Infinite M200 Pro)；小型垂直電泳槽(Bio-rad，型號：Mini PROTEAN Tetra)；小型轉印槽(Bio-rad，型號：Mini Trans-Blot)；凝膠成像系統(Bio-rad，型號：ChemiDoc XRS+)。

2 方法

2.1 細胞培養采用含有10% FBS，50 U·mL-1青霉素和50 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640培養液培養HepG2細胞，置于6孔板培養3 h(37 ℃，5% CO2)。用培養基小心清洗未黏附的細胞，然后加入含有10% FBS，rhGM-CSF(1 000 U·mL-1)，50 U·mL-1青霉素和50 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640培養液，每2天置換一半新鮮培養液。

2.2 MTT實驗取對數生長期的HepG2細胞，用0.25%胰蛋白酶消化5min，收集培養瓶中細胞。用RPMI1640 培養液制備成細胞懸液，并對細胞進行計數，使細胞密度為1×105個·mL-1。之后將細胞懸液接種于96孔培養板中，每孔為100 μL，培養12 h，使細胞貼壁生長。細胞分為空白對照組(Normal)、片仔癀不同濃度劑量組(濃度分別為1、10、100 mg·L-1)，每孔DMSO的使用濃度為0.5%，每組細胞設6個重復復孔，培養24 h后，吸棄孔中的培養液，并每孔加入已配好的MTT 溶液10 μL，MTT濃度為5 mg·mL-1，于37 ℃ 孵育4 h 后吸棄各孔中的培養液，加入100 μL 的DMSO，振蕩混勻2min，使結晶充分溶解，用多功能酶標儀測定各孔吸光度值(即A 值)，檢測波長為570 nm，細胞活力的計算公式如下。

HepG2細胞活力/%=[各實驗組A值/對照組A值]×100%。

2.3 集落形成實驗取對數生長期的HepG2細胞，6孔板每孔接種2×105個細胞，培養12 h后，分別用片仔癀不同濃度劑量組(濃度分別為1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1)作用，培養24 h，每孔接種2×105細胞于6孔板，用RPMI1640 培養液培養，隔天更換1次培養，培養時間為7～8 d，在倒置顯微鏡下，觀察并計算集落形成的情況與數量。

2.4 Western blot 檢測蛋白表達提取細胞總蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配置合適濃度的分離膠。上樣，電泳至藍色帶剛好跑到凝膠底部時終止電泳。轉膜成功后TBS洗一遍，把PVDF膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。孵育一抗：封閉好的PVDF膜用TBS洗滌10 min，按抗體說明書提供稀釋比例加入一抗稀釋液，各一抗稀釋倍數分別為Bax一抗(1 ∶800)、Bcl-2一抗(1 ∶800)、cleaved caspase-3一抗(1 ∶800)、cleaved caspase-9一抗(1 ∶600)、ANXA1一抗(1 ∶800)、VEGF一抗(1 ∶800)、VEGFR一抗(1 ∶800)、NF-κB p50一抗(1 ∶600)、PCNA(1 ∶3 000)、β-actin(1 ∶3 000)。4 ℃孵育過夜。孵育二抗，搖床室溫孵育2 h。收集二抗稀釋液，PVDF膜用TBS洗滌(10 min×3)，顯影。

3 結果

3.1 不同濃度的片仔癀對HepG2細胞活性的影響用MTT比色法檢測各組HepG2細胞的活性，研究發現，與空白對照組比較，經不同濃度片仔癀處理后，A值明顯升高(P<0.05)，且隨著片仔癀濃度的升高，抑制作用也逐漸增強，見Fig 1。

*P<0.05,**P<0.01vsnormal

用集落形成實驗檢測不同濃度的片仔癀對HepG2細胞集落形成能力(即細胞存活能力)的影響，研究發現，與空白對照組比較，不同濃度的片仔癀能夠抑制HepG2細胞集落形成數量，且隨著片仔癀濃度的升高，對HepG2細胞存活的抑制作用也增強(P<0.05)，見Fig 2。

3.2 不同濃度的片仔癀對HepG2細胞凋亡相關蛋白的影響研究發現，與空白對照組比較，經不同濃度片仔癀作用后，能夠促進細胞凋亡的Bax，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9蛋白的表達，同時抑制Bcl-2蛋白的表達，結果表明，片仔癀對HepG2細胞的凋亡相關蛋白具有一定作用，且隨著片仔癀濃度升高，對HepG2細胞凋亡的抑制作用也增強，見Fig 3。

Fig 2 Effect of PZH on HepG2 cell survival n=6)*P<0.05, **P<0.01 vs normal

Fig 3 Effect of salidroside on Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 protein expression of HepG2 n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal

3.3 不同濃度的片仔癀調控膜聯蛋白A1/VEGF通路對HepG2細胞的影響研究發現，與空白對照組比較，經不同濃度片仔癀作用后，能夠促進ANXA1蛋白表達，且隨著片仔癀濃度升高，ANXA1蛋白也升高；同時，片仔癀能夠抑制VEGF及其受體VEGFR的蛋白表達，且隨著片仔癀濃度的升高，其抑制作用增強；提取HepG2細胞細胞核蛋白，檢測NF-κB p50核轉錄水平，結果表明，片仔癀能夠抑制NF-κB p50核轉錄水平，且隨著片仔癀濃度的升高，其抑制作用增強，見Fig 4。

Fig 4 Effect of salidroside on ANXA1, VEGF, VEGFR protein and NF-κB p50 nuclear protein expression of HepG2 n=6)

**P<0.01vsnormal

4 討論

肝癌在全球癌癥發病率排名第六位，其致死人數排名第四位的惡性腫瘤[8]。目前早期肝細胞癌的治療主要以外科手術切除為首選[9]，但術后復發率高，預后較差。因此，探索抑制肝細胞癌發生發展的分子機制，尋找更有效安全治療藥物是當務之急。片仔癀是我國的傳統名貴中成藥，常用于急慢性病毒性肝炎，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效。近年來，越來越多關于片仔癀對肝細胞性肝癌患者的研究，本文主要研究片仔癀對人肝癌細胞系 HepG2 作用的影響，結果表明，片仔癀能夠抑制HepG2細胞活性及抑制HepG2細胞集落形成數量(即細胞存活能力)。

腫瘤細胞是通過在細胞內外過度表達抗凋亡因子，使平衡朝向自身生存，對細胞凋亡抵抗，從而導致腫瘤生長控制的喪失[10-11]。Bcl家族的蛋白在細胞凋亡過程中起到非常重要的引導作用，主要包括促凋亡基因，如Bax，及抗凋亡基因，如Bcl-2[12-13]。caspase-3 是由CASP3基因編碼的，外部死亡受體途徑和內在線粒體途徑啟動后共同的效應酶，在肝癌細胞凋亡中明顯表達[14]。而caspase-9由 CASP9 基因編碼的凋亡啟動蛋白酶，通過磷酸化再進行調控激活，引發線粒體內部活化凋亡途徑，誘導細胞凋亡是癌癥治療中細胞死亡的首選模式[15]，是癌癥治療關鍵。本研究通過檢測片仔癀對HepG2細胞凋亡相關蛋白的影響，發現片仔癀可以促進促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段的表達，減少抗凋亡基因 Bcl-2 的表達，對凋亡相關蛋白具有調控作用。

為進一步探討片仔癀抑制HepG2細胞活性及對凋亡相關蛋白調控作用的機制，本研究立足于ANXA1及下游通路的活化，ANXA1參與調控細胞凋亡和信號傳導等進程[5]，ANXA1表達的增加與NF-κB活性增強關系密切，NF-κB能夠控制細胞增殖和癌變，且可促進腫瘤的侵襲轉移；VEGF在腫瘤細胞和相鄰免疫細胞中，以自分泌或旁分泌的方式影響著早期腫瘤血管的發生發展過程[7]。在此基礎上，本研究發現片仔癀可以促進ANXA1蛋白表達，抑制其下游蛋白VEGF及其受體VEGFR的表達，抑制血管內皮細胞生長因子分泌作用；同時，其能夠抑制核蛋白NF-κB p50核轉錄水平，作用于腫瘤炎癥。

綜上所述，片仔癀能夠抑制腫瘤細胞HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡，與其能夠促進ANXA1蛋白表達，抑制VEGF及其受體VEGFR，進而抑制核蛋白NF-κB p50核轉錄水平，促進促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段的表達，減少抗凋亡基因 Bcl-2的表達有關。本實驗研究結果表明，片仔癀具有潛在的抗癌作用，利用細胞實驗探討片仔癀對肝癌細胞的作用及其分子機制，以期為臨床應用片仔癀治療肝癌提供新的理論根據，為肝癌的藥物治療開辟新途徑。

(致謝：本實驗在福建中醫藥大學生物醫藥研發中心完成，感謝各位老師的幫助與支持！)