SSR標記馬鈴薯育成品種的遺傳多樣性分析

王 鵬，李芳弟，郭天順，竇俊煥，頡煒清，羅照霞，齊小東，楊 晨，趙中梁，宋 怡，呂 汰

（甘肅省天水市農業科學研究所，甘肅 天水 741001）

隨著馬鈴薯主糧化發展和加工業企業興起的需要，育成的品種除具備抗病、高產特性外，還需適宜食品加工（炸片、炸條、淀粉、全粉）和鮮薯出口。甘肅省天水市農業科學研究所由于馬鈴薯種質資源保存與利用滯后，育種缺乏優質親本，現已育成品種主要以甘肅省平涼市莊浪縣農機推廣中心育成的品種‘莊薯3 號’和甘肅省天水市農業科學研究所自育品系‘天99-5-4’為親本。

種質的價值決定于種質自身的遺傳多樣性、可利用性和有效性[1]。在育種實踐中，環境及人為因素的影響使得選擇過程操作起來較為困難，而利用DNA指紋差異則可直接提供與目標性狀有關的DNA水平信息，避免了環境干擾，從而大大提高了雜交育種對親本及后代理想單株的選擇效率[2]。國外分子標記技術用于馬鈴薯遺傳多樣性研究較早[3-6]。近年來，Gavrilenko等[7]利用SSR標記技術對237份具有栽培馬鈴薯特性的種質和155份具有野生種特性并接近栽培種種質的遺傳多樣性進行分析，并分析其與野生種的遺傳關系，結果表明，所有的材料聚為A、B 兩大類，A 類包括了具有二倍體、三倍體和四倍體的栽培種和部分具有野生型親本的種質，B類包括大部分的野生型種質和雜交栽培種。國內分子標記技術用于馬鈴薯遺傳多樣性研究相比國外較晚[8-14]。Wang Fang 等[15]利用AFLP 分子標記技術對123份引自國際馬鈴薯中心（CIP）及部分國內育成馬鈴薯品種進行遺傳多樣性分析，結果表明，CIP引進馬鈴薯種質遺傳多樣性豐富，中國馬鈴薯品種遺傳相似度較高，遺傳基礎狹窄，可以利用CIP資源來拓寬中國馬鈴薯狹窄的遺傳基礎。

為了擴大馬鈴薯種質資源基因庫，迎合中國馬鈴薯主食化發展及對主食化品種的需求，甘肅省天水市農業科學研究所近兩年收集并引進不同基因型的馬鈴薯資源。為進一步將這些資源材料用于馬鈴薯育種親本的選配中，本研究利用引進的國內育成馬鈴薯品種以及甘肅省主要育成的部分馬鈴薯品種，用SSR分子標記檢測方法對其遺傳關系進行研究，明確甘肅省部分馬鈴薯栽培品種與引進馬鈴薯品種的遺傳多樣性，為拓寬甘肅省馬鈴薯育成品種遺傳基礎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 參試材料

馬鈴薯品種共計65個（表1），包括甘肅省育成品種14個，引進馬鈴薯品種47個，甘肅省天水市地方品種4個。

1.2 馬鈴薯基因組DNA的提取

摘取馬鈴薯田間幼嫩葉片，利用改良的CTAB法[16]提取馬鈴薯基因組DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質量和完整性。

1.3 SSR引物篩選

采用輪篩法篩選多態性較好的引物，第1輪隨機選取‘天薯11號’和‘中薯18號’，SSR引物來自于公開發表的文獻[6,17,18]，從100對引物中篩選出在兩份材料間有條帶的引物；第2輪以5份材料（‘天薯10號’、‘隴薯7號’、‘中薯10號’、‘云薯506’、‘麗薯10號’）進一步篩選出多態性指數較高的引物，引物多態性指數PPB（Percentage of polymorphic bands）：PPB（%）=（K/N）×100，（其中K 為擴增多態性條帶數，N為擴增條帶總數）。用篩選出的多態性指數較高的SSR引物對供試馬鈴薯品種進行擴增分析。

表1 供試材料名稱及來源Table 1 Names and sources of materials

續表1Continued Table 1

1.4 PCR擴增和電泳檢測

1.4.1 PCR擴增體系

PCR 反 應在Eppendorf Master-cycler PCR 擴增儀上進行。SSR反應體系和程序按照Ghislain等[6]的方法，SSR-PCR體系（10 μL）：2×Taq PCR Master Mix（中科瑞泰生物科技有限公司）5 L，10 ng/μL上游引物和下游引物各1 μL，100 ng/μL 模板DNA 1 μL，ddH2O 2 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，復性（以引物最適退火溫度而定）50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4.2 PAGE凝膠電泳檢測

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR產物進行電泳（恒功率70 W 電泳1.5 h）。凝膠染色步驟：ddH2O 漂洗2～3 min，2 g/L 硝酸銀染色15 min，蒸餾水漂洗30 s，20 g/L氫氧化鈉中加入37%甲醛4 mL顯色至條帶清晰可見，蒸餾水漂洗，照相。

1.5 SSR數據統計分析

對擴增后清晰、穩定、易讀的條帶采用‘0-1’系統記錄其位置，在相同的遷移位置上有帶記‘1’，無帶記‘0’，構建‘0,1’二元數據矩陣。利用NTSYS-pc 2.1遺傳多樣性分析軟件計算供試材料之間的遺傳相似系數，按照UPGMA（Un-weighted pair group method using arithmetic averages）方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SSR多態性引物篩選

篩選出25對多態性指數較高的馬鈴薯SSR引物（表2）。

2.2 SSR標記多態性分析

利用篩選出的25 對多態性指數較高的SSR 引物，對65 份馬鈴薯品種進行SSR 擴增分析。擴增結果顯示，25 對引物共檢測出145 個清晰、穩定、易讀的條帶，引物擴增條帶數為3～12 個，平均每對引物擴增出5.88 個條帶，其中，多態性條帶145 個，平均多態性比率為100%。引物STI005擴增出的條帶數最多（12個），擴增條帶數最少的為引 物STM1104、STGBSS、SSR594、STM1106 和STI052，條帶總數均為3 個（表2）。圖1 為引物STI052對部分馬鈴薯基因型的擴增結果。

表2 馬鈴薯品種SSR分析的多態性引物序列Table 2 Polymorphic primer sequences of potato variety SSR analysis

圖1 引物STI052對部分馬鈴薯品種的SSR擴增Figure 1 SSR amplification of some potato varieties by Primer STI052

2.3 供試馬鈴薯品種的親緣關系

用NTSYS-pc 2.1數據分析軟件計算了65份供試馬鈴薯品種兩兩之間的遺傳相似系數（Genetic similarity,GS）在0.60～0.93，平均遺傳相似系數為0.76。基于遺傳相似系數用類平均法（UPGMA）對供試材料進行聚類，結果表明（圖2），在GS 為0.60時，供試材料分為兩大類，‘華恩1 號’單獨聚為一類，該品種為華中農業大學、湖北恩施中國南方馬鈴薯研究中心從雜交組合‘395049’的子代實生系中選擇優良單株經無性繁殖而成的品種。其余64 份材料聚為第二類；在GS 為0.61 時，第二類又分為兩個亞類，‘農天1 號’、‘甘谷紫’、‘天薯9 號’、‘五龍洋芋’、‘天薯10 號’聚為第一亞類；其余59份材料聚為第二亞類；‘農天1號’、‘天薯9號’和‘天薯10號’為甘肅省天水市農業科學研究所先后選育的品種，‘農天1號’和‘天薯10號’共同親本是‘莊薯3號’，其中，‘甘谷紫’和‘五龍洋芋’均為天水地方品種。在GS為0.64時，第二亞類又分為2個亞亞類：第1亞亞類為‘天薯11號’、‘青薯10號’、‘青薯6號’、‘甘谷紅’和‘秦州紅’，其中，青海省農業科學院作物研究所育成的‘青薯10號’和‘青薯6 號’相似系數最高，達0.93，搜集于甘肅省天水市不同的兩個縣區的地方品種‘甘谷紅’和‘秦州紅’相似系數較高，達0.88，其外觀（薯型、薯皮、芽眼等）有一定的相似性，其余54 份材料聚為第2 亞亞類：在GS為0.65時，‘延薯系列（延薯4、7、8、9、10）’、‘鄂馬鈴薯11號’和‘米拉’7份材料被聚為一組，在GS為0.66時，‘隴薯13號’和‘夏波蒂’，‘紅玫瑰’、‘希森6號’、‘克新22號’和‘蘇蘭1號’分別聚在一起，其余41 份材料（占供試材料的63.08%）：在GS 為0.67 時，‘中薯7 號’、‘虎頭’、‘中薯18號’、‘大西洋’、‘早大白’、‘鄂薯5號’、‘麗薯6號’、‘云薯605’、‘宣薯5號’、‘中薯19號’、‘川涼薯7號’、‘畢薯2號’和‘克新6號’13份材料聚在一起，在GS為0.68時，‘青薯2號’、‘冀張薯14號’、‘冀張薯8號’、‘云薯201’、‘蒙薯17號’、‘蒙薯10號’、‘中薯3號’、‘鄭薯7號’、‘農天2號’、‘中薯10號’、‘中薯11號’、‘天薯13號’、‘青薯9號’、‘希森5號’、‘希森3號’、‘隴薯12號’、‘費烏瑞它’、‘冀張薯12號’和‘隴薯6號’19份材料聚為一組，在GS為0.70時，‘隴薯8號’、‘隴薯7號’、‘莊薯4號’、‘肯德’、‘天薯12號’、‘中薯8號’、‘隴薯10號’、‘青薯7號’和‘訥薯16號’9份材料聚在一起。來自于美國的薯片加工型品種‘大西洋’、來自于德國的中晚熟品種‘米拉’、來自于加拿大的薯條加工型品種‘夏波蒂’與國內育成品種的遺傳差異并不十分明顯，這可能是由于這些品種被引進國內后，將其作為親本反復利用，與國內育成品種做過很多雜交，因此，育成品種中有其血緣，遺傳關系較近，遺傳差異較小。

圖2 供試馬鈴薯品種的聚類Figure 2 Cluster analysis of tested potato varieties

就供試馬鈴薯品種的遺傳距離（Genetic distance，GD）來看，樂陵希森馬鈴薯產業集團有限公司育成的早熟馬鈴薯品種‘希森3號’與甘肅省天水市農業科學研究所育成的晚熟淀粉加工型品種（淀粉含量達19.44%）‘天薯10 號’、甘肅農業大學與天水市農業科學研究所合作育成的鮮食菜用型馬鈴薯品種‘農天1號’遺傳距離最大（GD=1.000 0），‘希森3號’與‘天薯9號’差異也較大；‘天薯10 號’與‘紅玫瑰’、‘希森3 號’與‘五龍洋芋’親緣關系最遠，遺傳距離最大，均為0.922 4，‘農天1號’與早熟品種‘費烏瑞它’（GD=0.862 5）、‘紅玫瑰’、‘延薯4號’、‘云薯605’遺傳差異均較大，親緣關系較遠；‘天薯10 號’與‘延薯10 號’（GD=0.853 7）、‘肯德’、‘夏波蒂’的親緣關系均較遠，遺傳距離均大于0.800 0，其次，‘天薯10號’與‘米拉’、‘延薯9號’、‘蒙薯10號’、‘隴薯12號’、‘中薯7號’、‘中薯19號’、‘蘇蘭1號’、‘希森5號’、‘中薯3號’、‘云薯605’遺傳差異也較大，‘天薯10號’和‘農天1號’是當地育種單位重要的育種親本，在馬鈴薯雜交育種中，可以利用‘天薯10號’、‘農天1號’與上述遺傳差異較大的品種進行雜交選配工作，進而為選育出綜合性狀優異的馬鈴薯新品種奠定基礎。部分供試馬鈴薯品種的遺傳距離見表3。

3 討 論

馬鈴薯品種來源、遺傳距離和遺傳背景差異較大的在聚類圖（圖2）中被分離出聚為一類，如‘華恩1號’、‘天薯11號’、‘鄂馬鈴薯11號’等。來源相同或同一育種單位的育成品種，遺傳差異較小、距離較近，如甘肅天水地方品種和育成品種‘農天1號’、‘天薯9號’、‘天薯10號’、‘甘谷紫’和‘五龍洋芋’聚在一起，‘延薯4號’、‘延薯7號’、‘延薯8號’、‘延薯9號’和‘延薯10號’聚在一起，‘青薯10號’和‘青薯6 號’、‘青薯7 號’和‘訥薯16 號’、‘中薯10號’和‘中薯11 號’、‘蒙薯10 號’和‘蒙薯17 號’、‘冀張薯8號’和‘冀張薯12號’分別聚在一起。這可能由于相同栽培區域和各育種單位集中化利用親本，所以同一個育種單位培育的品種大多聚在相同類群中，該結果與時啟冬等[19]和段艷鳳等[20]的研究結果一致。比如，‘延薯9號’是吉林省延邊朝鮮族自治州農業科學研究院以‘延薯8 號’為母本、‘早大白’為父本育成的中晚熟品種，‘延薯7號’是以‘延薯4號’為母本、‘早大白’為父本，有性雜交獲得實生籽，經過各世代鑒定篩選而育成。所以都聚在一起，由此也證明了SSR分子標記方法在作物品種血緣關系分析中的準確性與可靠性。

在本研究中有些聚類分析結果與實際的親緣關系不太符合，如‘青薯10號’和‘青薯6號’在本研究中相似系數較高，兩個品種均為青海省農業科學院作物研究所先后選育而成，‘青薯10號’是從國際馬鈴 薯 中 心（CIP）引 進 雜 交 組 合（‘387521.3’בAphrodite’）材料‘C92.140-05’中選出優良單株ZT，后經系統選育而成，而‘青薯6號’親本為‘固33-1’和‘92-9-44’（‘73-21-1’בDesiree’），兩個品種沒有共同的親本，此結果的產生可能與研究中所選的SSR引物及其數量有關，擴增獲得的多態性條帶有限，不能充分表現出材料之間真實的遺傳關系。

也有不同來源的品種相似性較高，如‘大西洋’和‘中薯18號’、‘費烏瑞它’和‘冀張薯12號’、‘中薯3號’和‘鄭薯7號’、‘隴薯7號’和‘莊薯4號’等，‘中薯18 號’是中國農業科學院蔬菜花卉研究所用‘C91.628’בC93.154’選育的品種，‘大西洋’親本為‘B5141-6’（Lenape）בWauseon’，是1978 年由農業部和中國農業科學院引入中國，這很可能是不同育種單位間相互引種，共用親本，使得這些品種具有共同的血緣，遺傳差異較小。但是，部分血緣關系較近的品種相似性卻不高，比如，早熟品種‘鄭薯7 號’為河南省鄭州市蔬菜研究所利用‘費烏瑞它’為母本、‘豫馬鈴薯1號’為父本育成，炸片加工型品種‘大西洋’為‘冀張薯12號’的母本，可是，

在本研究中，‘鄭薯7號’與其母本早熟品種‘費烏瑞它’、‘冀張薯12號’與‘大西洋’卻相聚較遠，這可能是雜交后代中群體分離比較大，使其與親本間發生了較大的遺傳差異。

表3 部分供試馬鈴薯品種的遺傳距離Table 3 Genetic distance of some potato varieties

馬鈴薯在中國屬于外來作物，因此，馬鈴薯種質資源十分有限，本研究通過對甘肅省主要育成馬鈴薯品種和引進品種的遺傳多樣性進行分析，發現部分引進主食化馬鈴薯品種與甘肅省育成品種遺傳差異較大，是較好的親本資源，應加大其今后在馬鈴薯育種中的應用。