基于AMPK/SREBP-1通路研究狗肝菜多糖對高脂飲食大鼠糖脂代謝的影響

張可鋒，高 雅，曹后康，鐘明利，晉 玲

1甘肅中醫藥大學藥學院，蘭州 730000；2桂林醫學院藥學院，桂林 541004

代謝綜合征是指人體中脂肪、蛋白質和碳水化合物等物質代謝產生紊亂的病理狀態，常伴有肥胖、高血糖、高血壓、血脂異常及高胰島素血癥等[1]。而糖脂代謝紊亂是代謝綜合征的重要組成部分，會增加心腦血管疾病及糖尿病的發生率[2]。近年來，由于人們生活方式的改變，營養過剩引起的代謝功能紊亂相關的疾病明顯增長，嚴重影響人們的生活質量以及健康，尋找調節糖脂代謝紊亂的有效策略、藥物顯得十分迫切[3]。多糖是一種天然高分子聚合物，具有抗氧化、調節血脂異常、抗炎癥、胰島素增敏等多種生物活性，被廣泛應用于醫療保健領域[4]。狗肝菜具有涼血解毒、生津散熱等功效，是廣西民間常用的壯藥，廣泛分布于中國南方，如廣西、廣東、福建等地[5]。前期研究證明，狗肝菜多糖(DCP)能夠抑制酒精性脂肪肝其氧化應激及炎癥反應達到保肝作用[6]，但對其糖脂代謝及調控機制有關的研究報道尚無有關報道。因此，本實驗在課題組前期基礎上，基于AMPK/SREBP-1通路，進一步研究DCP對高脂大鼠糖脂代謝的作用，并探討其作用機制。

1 材料與試劑

1.1 試驗藥物

狗肝菜采購于廣西桂林市七星區六合路中藥材市場，經廣西中醫藥大學藥用植物學教研室韋松基教授鑒定為爵床科狗肝菜屬植物狗肝菜Diclipterachinensis(L.) Ness.的全草。狗肝菜多糖提取和純化方法見參考文獻[7]。

1.2 動物

健康SPF級SD大鼠46只，10周齡，體重200 ± 20 g，由桂林醫學院SPF實驗動物中心提供，許可證號SYXK2013(桂)-0001。

1.3 試劑

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、游離脂肪酸(FFA)、糖基化終產物-肽(AGE-P)、糖化血紅蛋白(HbA1c)和肝糖原試劑盒(南京建成生物工程公司)，高脂飼料(江蘇美迪森生物醫藥有限公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術研究所)，PVDF膜(美國Bio-Rad公司)，SREBP-1抗體(美國Cruz公司)，p-AMPK抗體和AMPK抗體(美國CST公司)，β-actin單抗和辣根酶標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Super ECL Plus超敏發光液(北京橋生物科技有限公司)，實時熒光定量PCR試劑(北京康為世紀生物科技有限公司)。

1.4 儀器

Epoch酶標儀(美國Bio-Tek公司)，UW-2200H電子天平(日本島津公司)，TGL-16K臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)，OLYMPUS BX51顯微鏡(奧林巴斯公司)，電泳儀和轉膜儀(美國Bio-Rad公司)，PTC-200型PCR儀(美國Bio-Rad公司)，全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組與處理

首先將46只SD大鼠分為2組，即正常組(n=13)、高脂組(n=33)，正常組喂普通鼠糧，高脂組喂高脂飼料造模，8周后，從正常組和高脂組中各隨機抽取3只，進行病理檢查，確定建模成功。將剩余的40只大鼠隨機均分為正常組、模型組、DCP劑量組(100、200 mg/kg)，每組10只。除正常組給予正常飼料外，其余各組均用高脂飼料喂養14周，從第9周開始，DCP劑量組灌胃給藥，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次，持續給藥6周[8]。最后1次灌胃結束后禁食不禁水16 h，收集血樣和肝臟。血樣離心15 min(4 500 rpm)，-20 ℃保存，按各劑盒操作流程檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA含量。肝臟于液氮中保存。

2.2 血清脂質含量檢測

根據試劑盒說明吸取離心好的血清，在冰浴上依次加入相應試劑，顯色后，置酶標儀上，在各自特定波長下依次測定血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA含量。

2.3 肝組織TG含量檢測

根據試劑盒說明進行指標測定，取一定重量的肝組織，加入9倍體積的冷生理鹽水，冰浴手工勻漿，離心勻漿液，取上清液進行TG和肝糖原含量測定。

2.4 血清血糖、FINS、AGE-P和HbA1c和肝糖原含量檢測

葡萄糖氧化酶法測定血清FBG含量，ELISA法檢測血清FINS含量，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)，血清AGE-P和HbA1c和肝糖原含量采用生化法進行檢測。

2.5 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

隨機選取同一位置肝組織并切取約50 mg置于玻璃勻漿器中，加入RIPA裂解液(含PMSF和蛋白磷酸酶抑制劑)1 mL，于低溫下研成勻漿，4 ℃下，轉速12 000×g離心15 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度并進行定量。各組取30 μg變性蛋白上樣，經10% SDS-PAGE分離蛋白(濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓110 V)；冰浴條件下恒流電轉(220 mA電流，3 h)至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶在室溫和搖床條件下輕搖封閉2 h；TBST洗膜3次，每次10分鐘，一抗4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜后，使用上海天能全自動化學發光系統成像，使用Quantity One軟件分析條帶蛋白灰度，以β-actin為內參，正常組作為參照，蛋白表達量進行歸一化處理計算蛋白相對表達量。

2.6 肝組織SREBP-1和AMPK mRNA水平檢測

采用Trizol試劑從肝臟中提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，反應體系為50 μL：2xUltraSYBR Mixture 25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。反應程序為：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。引物序列為：β-actin(5′- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′,5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′)，AMPK(5′-TAGACAGAAGATTCGCAGTT-3′,5′-CCAGACACATATTCCATTACC-3′)，SREBP-1(5′- CCATTGACAAGGCCATGC-3′,5′-GGTCATGTTGGAA ACCACGC-3′)。依據Ct值，以正常組作為參照，各組SREBP-1和AMPK mRNA表達量進行歸一化處理計算相對表達量。

2.7 統計學處理

3 結果與分析

3.1 DCP對血清中脂質及肝臟TG含量的影響

與正常組相比較，模型組大鼠血清中的TC、TG和LDL-C含量顯著提高(P< 0.01)，HDL-C含量顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，除DCP(100 mg/kg)劑量組對LDL-C無統計學差異外，其余DCP劑量組能降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的含量(P< 0.05或P< 0.01)，顯著提高HDL-C含量(P< 0.01)；與正常組比較，模型組大鼠肝臟中的TG和FFA含量顯著升高(P< 0.01)，與模型組比較，DCP劑量組能顯著降低TG和FFA含量(P< 0.05或P< 0.01)(見表1和2)。

3.2 DCP對胰島素抵抗的影響

與正常組相比較，模型組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR升高(P< 0.01)；與模型組相比較，DCP劑量組均可以有效降低高脂飲食大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR(P< 0.01或P< 0.05)，說明經DCP干預，可以改善胰島素抵抗(見表3)。

表1 DCP對血清中脂質含量的影響

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05；**P< 0.01.

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,*P< 0.05;**P< 0.01.

表2 DCP對肝組織TG和血清FFA的影響

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05；**P< 0.01.

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,*P< 0.05;**P< 0.01.

表3 DCP對胰島素抵抗的影響

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05；**P< 0.01.

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.3 DCP對血清AGE-P、HbAlc和肝糖原的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中AGE-P和HbAlc含量明顯增加(P< 0.01)，而肝糖原含量顯著降低(P< 0.01)；與模型組相比，DCP劑量組均可明顯降低高脂飲食大鼠血清AGE-P和HbAlc含量(P< 0.01)，并增加肝糖原含量(P< 0.01或P< 0.05)。見表4。

表4 DCP對血清AGE-P、HbAlc和肝糖原的影響

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05；**P< 0.01.

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.4 DCP對大鼠肝組織病理形態的影響

肝組織經油紅O染色，正常組大鼠未見染紅脂肪空泡，無炎性細胞浸潤現象；模型組呈現大面積的紅色的脂肪滴，其周圍大多伴有炎性浸潤(如箭頭所示)；經DCP干預的大鼠肝臟，紅色的脂肪沉積物和炎性細胞數量明顯減少，其中200 mg/kg劑量尤其減少顯著(見圖1)。

3.5 DCP對肝組織AMPK和SREBP-1蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，各組大鼠肝組織中AMPK總蛋白無差異性，其磷酸后(p-AMPK)，與正常組比較，模型組大鼠肝組織的p-AMPK蛋白表達下降(P< 0.01)，SREBP-1蛋白表達升高(P<0.01)。與模型組相比較，DCP劑量組p-AMPK蛋白表達上調(P< 0.01)，SREBP-1蛋白表達下調(P< 0.01或P< 0.05)，表明DCP調節糖脂代謝可能與AMPK/SREBP-1信號通路有關(見圖2)。

3.6 DCP對肝組織AMPK mRNA和SREBP-1 mRNA水平的影響

RT-PCR實驗結果顯示，各實驗組AMPK mRNA

圖1 DCP對大鼠肝組織病理形態的影響(400×)Fig.1 Effects of DCP on the Pathological Morphology of Liver Tissues in Rats (400×)注：A：正常組；B：模型組；C：DCP劑量組(100 mg/kg)；D：DCP劑量組(200 mg/kg)；Note:A:Normal group;B:Model group;C:DCP dose group(100 mg/kg);D:DCP dose group(200 mg/kg)

圖2 DCP對p-AMPK和SREBP-1蛋白表達的影響Fig.2 Effect on the p-AMPK and SREBP-1 protein of DCP注：A：正常組；B：模型組；C：DCP劑量組(100 mg/kg)；D：DCP劑量組(200 mg/kg)；與正常組比較，## P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；** P < 0.01.Note:A:Normal group;B:Model group;C:DCP dose group(100 mg/kg);D:DCP dose group(200 mg/kg);Compared with normal group, ## P < 0.01;Compared with model group,*P < 0.05;** P<0.01.

水平差異無統計學意義(P> 0.05)；與正常組比較，模型組大鼠肝組織的SREBP-1 mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組相比較，DCP劑量組SREBP-1 mRNA表達下調(P<0.01或P<0.05)(見圖3)。

圖3 DCP對肝組織AMPK mRNA和SREBP-1 mRNA水平的影響Fig.3 The effects of DCP on AMPK mRNA,SREBP-1 mRNA in the 5)注：A：正常組；B：模型組；C：DCP劑量組(100 mg/kg)；D：DCP劑量組(200 mg/kg)；與正常組比較，## P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05；** P < 0.01.Note:A:Normal group;B:Model group;C:DCP dose group(100 mg/kg);D:DCP dose group(200 mg/kg);Compared with normal group,## P < 0.01;Compared with model group,*P < 0.05;** P < 0.01.

4 結論

血脂紊亂是脂代謝異常的表現之一，主要為血清中TC、TG、LDL-C的升高和HDL-C的降低[9]。當外周組織對胰島素敏感性下降時，血液中胰高血糖素水平上升，脂肪分解増加，釋放大量游離脂肪酸，其中一部分進入肝臟，多余的又進入體循環，促使肝臟合成脂類物質増加，TG合成增多[10]。過量的FFA可轉化為TG儲存于肝細胞中，引起TG堆積，HDL-C水平下降，且LDL-C與其受體的結合力降低，促進LDL-C水平的上升[11,12]。脂質代謝與糖代謝關系密切，FFA水平增高后常富集在脂肪和肝臟等胰島素靶器官，導致器官對胰島素敏感性下降，而這些器官攝取葡萄糖能力的下降，又會增加糖異生，導致胰島素抵抗的發生[13]。營養過剩引發的FFA增加，促進肝臟TG堆積，降低胰島素促進糖原合成和抑制糖異生的能力，導致胰島素抵抗的形成，同時還常伴有血脂異常，可增加冠心病等動脈粥樣硬化性疾病的風險[14]。AGE-P可與靶組織或蛋白(如低密度脂蛋白)再次形成第二代AGEs,該連鎖反應往往會加重尿毒癥、糖尿病和血管病變等[15]。HbAlc在臨床上常用于評定糖尿病患者的血糖控制程度，高濃度的血糖可與血紅蛋白結合引起糖化血紅蛋白的增高[16]。當肝細胞受損，導致肝細胞多種酶，尤其是糖原合酶體系被破壞，引起肝糖原的合成受阻，肝糖原含量下降[17]，這與本研究模型組中病理檢查出現的肝細胞炎癥和肝糖原測試數據下降相吻合。DCP可以有效降低大鼠血清中的TC、TG、LDL-C、AGE-P和HbAlc的含量，升高HDL-C和肝糖原含量，降低FBG、FINS和HOMA-IR水平，說明DCP可以有效調節高脂飲食造成的大鼠血脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗。

AMPK是維持機體細胞能量供需平衡的關鍵因子，其活化可磷酸化下游靶分子參與能量代謝進程，從而降低肝細胞的FFA釋放，促進脂肪酸氧化，抑制肝臟內脂質積聚[18]。SREBP-1是脂質代謝相關酶的關鍵調控因子，參與TC、TG和FFA的合成與攝取，是AMPK的重要下游調控靶點[19]。肝臟活檢結果顯示，非酒精性脂肪肝患者SREBP-1基因表達高于正常人，但AMPK基因無變化[20]。AMPK可使SREBP-1的372位點磷酸化，抑制SREBP-1的裂解和核易位，可使肝細胞TG和脂質積累減少[21]。此外，TC、TG、LDL-C、FBG、FINS水平升高是胰島素抵抗(IR)的主要特征[22]；而IR又可抑制AMPK活性，增強SREBP-1表達，增加脂質合成，降低脂質氧化，增加肝臟TG含量，從而引起機體惡性循環[23]。在我們目前的研究中，高脂大鼠的肝臟中SREBP-1 mRNA和蛋白質的表達高于正常大鼠，而高脂大鼠肝中p-AMPK水平被抑制。DCP干預后，p-AMPK水平升高，SREBP-1 mRNA和蛋白表達降低，我們推測DCP調節高脂飲食大鼠糖脂代謝紊亂的機制可能與AMPK/SREBP-1通路有關。

綜上所述，DCP對高脂飲食大鼠的糖脂代謝具有一定的調節作用，其作用機制可能與調控AMPK/SREBP-1通路有關。