2015-2017年聊城市腹瀉病例中沙門氏菌分子分型及耐藥性研究

杜銀菊，梁勝楠，段 瑤，李曉迪，徐可心，郭海燕，程利紅，王 飛，劉 雨，苗雪峰，李心朋

沙門氏菌是一種血清型別眾多，分布廣且人獸共患的常見病原菌。該菌主要通過食物(尤其是禽肉)感染人類，引起食源性疾病，如腸傷寒、敗血癥等，嚴重者可導致死亡[1]。而不同血清型的沙門氏菌致病力及耐藥性顯著不同[2]，因此沙門氏菌的血清分型及耐藥分析對臨床研究和疾病控制都有重大意義。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，對沙門氏菌的監(jiān)測研究進入分子水平。脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)通過比較菌株“DNA指紋圖譜”的相似性，推斷菌株的同源性，幫助追蹤、識別傳染源和傳播途徑，對傳染病的監(jiān)測有著非常重要的意義[3]。

近年來隨著抗生素的不斷使用，病原菌的耐藥性不斷增強，耐藥率和耐藥范圍都呈現(xiàn)大幅上升趨勢，因此病原菌的耐藥性問題已成為世界范圍的公共健康和衛(wèi)生問題[4-5]。沙門氏菌作為重要的食源性致病菌及耐藥指示菌，其耐藥性越來越受到各界的重視。本文對山東省聊城地區(qū)食源性疾病監(jiān)測來源的41株沙門氏菌進行分子分型及耐藥性檢測，了解聊城地區(qū)沙門氏菌的分型和耐藥性特點，為減少和控制沙門氏菌在該地區(qū)的傳播與感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本實驗中41株沙門氏菌菌株分離自2015-2017年聊城市兩家食源性疾病哨點醫(yī)院859例腹瀉病人糞便標本。質(zhì)控菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC140128,藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，上述菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)，脈沖場凝膠電泳分子量標準菌株為沙門氏菌H9812，由山東省疾病預防控制中心細菌所提供。

1.2沙門氏菌分離鑒定與血清學分型 按照食品安全國家標準GB4789.4-2010及國家風險評估中心2010-2015年《食源性疾病監(jiān)測工作手冊》[6-7]進行沙門氏菌分離培養(yǎng)及鑒定；利用玻片凝集法進行血清凝集試驗，所用抗血清來自丹麥國家食品研究所，且均在有效期內(nèi)，根據(jù)White-Kauffmann-Le Minor抗原表確定菌株的血清型別。

1.3PFGE分型 參照美國疾病預防控制中心Pulse Net PFGE標準化方法[8]進行。使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進行酶切， 獲得的菌株 PFGE 圖像錄入 BioNumerics (Version 5. 1， Applied maths， Inc．) 軟件，使用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group average method，UPGMA) 進行聚類，構(gòu)建聚類樹，分析菌株間的相似性。

1.4藥物敏感試驗 藥敏實驗采用美國臨床實驗室標準研究所(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法(MIC)進行，定量測定其最低抑菌濃度。試驗共采用8種抗生素：環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)，甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole，SXT)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、萘啶酸(Nalidixic acid，NAL)、慶大霉素(Gentamicin，GEN)、四環(huán)素(Tetracycline，TET)、頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、頭孢西丁(Cefoxitin，CFX)，用全自動藥敏試驗菌液接種判讀儀和商品化的藥敏板(上海星佰生物技術(shù)有限公司)進行測定，按照CLSI2017標準判讀結(jié)果并確定其耐藥表型。實驗中大腸桿菌ATCC25922做為質(zhì)控菌株確保藥敏結(jié)果的可靠性。采用CLSI 推薦的方法進行產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)表型確證實驗，即當頭孢噻肟(0.25～16 μg/mL)或頭孢他啶(0.5～16 μg/mL)和克拉維酸(4 μg/mL)聯(lián)合獲得的MIC 值低于上述抗生素單藥 MIC 值3個稀釋度或以上, 即可判定為產(chǎn) ESBLs 菌株。

1.5耐藥基因 檢測運用文獻報道的blaCMY、blaCTX-M常見ESBLs型的引物[9-10]，PCR檢測產(chǎn) ESBLs菌株中編碼ESBLs基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。擴增陽性的PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠生物科技有限公司進行序列測定，所得序列BLAST比對后確定該耐藥菌株ESBLs基因型別。PCR反應總體積為50 μL，具體組成為：2×Pyrobest Taq PCR Mix(TaKaRa公司)25 μL，上下游引物(50 μmol/L)各0.4 μL，模板(水煮)2 μL。擴增CMY基因引物為CMY-F：5′ATGATGAAAAAATCGTTATGC3′，CMY-R：5′GCTT-TTCAAGAATGCGCCAG3′; 擴增CTX-M基因引物為: CTX-M-F: 5′TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA3′， CTX-M-R: 5′CGATATC-GTTGGTGGTGCCATA3′。擴增條件為：94 ℃預變性5 min，30個循環(huán)(94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s), 72 ℃補充延伸6 min。

1.6統(tǒng)計學分析 運用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。用χ2檢驗進行率的比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1沙門氏菌分離概況 2015-2017年共檢測哨點醫(yī)院腹瀉病患者標本573份，檢出沙門氏菌41株，總分離率7.16%。其中2016年沙門氏菌分離陽性率最高，為8.42%，2017年沙門氏菌陽性率有所降低，為7.03%(表1)。分離率在不同年齡階段存在差異(表2)：11歲以下患者分離率(8.31%)明顯高于11～30歲組(2.68%，χ2=4.090,P<0.05)，41例患者職業(yè)上散居兒童20例(48.78%)，托幼兒童6例(14.63%)，學生5例(12.20%)，農(nóng)民9例(21.95%)，干部職工1例(2.44%)，以散居兒童為主；男性22例，女性19例，女性患者檢出沙門氏菌血清型種類多于男性患者，相對分散于7個血清型，男性患者檢出的沙門氏菌血清型集中于鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌；臨床表現(xiàn)上發(fā)燒70.97%，腹瀉(平均6次/d)，腹痛35.48%，嘔吐38.71%，糞便多數(shù)呈水樣(46.34%)，部分伴有粘液或膿血。

表1 不同年份沙門氏菌檢出情況
Tab.1 Isolating ratio ofSalmonellaby year

年份標本數(shù)陽性數(shù)陽性率(%)2015198126.062016190168.422017185137.03合計573417.16

表2 不同年齡組沙門氏菌檢出情況
Tab.2 Detecting results ofSalmonellaby age group

年齡標本數(shù)陽性數(shù)陽性率(%)<11歲301258.3111-30歲11232.68≥30歲160138.13

2.2沙門氏菌血清型分布 對分離到的41株沙門氏菌進行血清分型，共鑒定出8個血清型(表3)，主要為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和病牛沙門氏菌，分別為18株、7株和5株。

2.3PFGE分型 情況對41株沙門氏菌進行PFGE分析，得到34種PFGE圖譜，帶型相同的有5組(2株鼠傷寒沙門氏菌，2株腸炎沙門氏菌，2株病牛沙門氏菌，2株都柏林沙門氏菌，1株腸炎沙門氏菌和1株都柏林沙門氏菌及1株鼠傷寒沙門氏菌)，其他沙門氏菌PFGE圖譜完全不同。41株沙門氏菌帶型相似度在49%～100%之間(圖1)。同一血清型沙門氏菌大部分菌株P(guān)FGE圖譜可聚集成簇，但腸炎沙門氏菌與都柏林沙門氏菌PFGE圖譜相似度較高，兩種血清型菌株部分聚集成簇存在(圖1)。根據(jù)該情況，對PFGE圖譜相似度較高的11株沙門氏菌重新進行血清凝集，結(jié)果仍顯示兩種不同的血清型(腸炎沙門氏菌與都柏林沙門氏菌)。

表3 44株人源沙門氏菌的血清型分布
Tab.3 Serotype distribution of 44Samonellaisolates from patients

血清型抗原式菌株數(shù)鼠傷寒沙門氏菌4,12:i:1,218腸炎沙門氏菌9,12:g,m:-7都柏林沙門氏菌9,12:g,p:-4病牛沙門氏菌8:r:1,55火雞沙門氏菌10: e,h:l,w4印第安納沙門氏菌4:z:7 1嬰兒沙門氏菌6,7:r:1,51湯普遜沙門氏菌7: k:51合計-41

2.4沙門氏菌耐藥概況 長期以來，我國各地學者對食源性和動物源性沙門氏菌的耐藥性進行了密切監(jiān)測和研究。本文選取臨床上常用的4大類抗生素中的8種進行研究，發(fā)現(xiàn)41株測試菌株，對四環(huán)素耐藥率最高，為73.17%，對氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星的耐藥率為41.46%，對頭孢噻肟較敏感，敏感率為73.17%(表4)。菌株多重耐藥現(xiàn)象明顯，多重耐藥率達68.29%，耐4種及以上抗生素的有18株，占43.90%(表5)。

41株菌共產(chǎn)生21個耐藥譜(表4，圖1)，TET-GEN-NAL-CHL-TMP-CIP為優(yōu)勢耐藥譜，主要存在于鼠傷寒沙門氏菌中。發(fā)現(xiàn)同一血清型的菌種其耐藥譜有很大相似性，有4株鼠傷寒只對一種抗生素具有抗藥性，有3株病牛沙門氏菌和1株鼠傷寒沙門氏菌的耐藥譜具有很大相似性(圖1)，其余的鼠傷寒沙門氏菌和病牛沙門氏菌都對兩種及兩種以上抗生素具有抗藥性。腸炎沙門氏菌與都柏林沙門氏菌的耐藥譜也有一定的相似性(表5，圖1)，大多數(shù)菌株只對一種抗生素具有抗藥性，其中有5株菌對2種及以上抗生素有抗藥性。

注：圖中耐藥部分顏色深淺表示耐藥程度，淺灰色表示敏感，深灰色表示中度敏感，黑色表示耐藥。圖1 沙門氏菌PFGE分子分型結(jié)果Fig.1 PFGE analysis of Salmonella

2.5產(chǎn)ESBL沙門氏菌耐藥基因檢測 經(jīng)ESBL表型確證實驗發(fā)現(xiàn)6株產(chǎn)ESBLs鼠傷寒沙門氏菌，產(chǎn)ESBLs沙門氏菌比例為14.63%，其中1株來自2015年，2株來自2016年，3株來自2017年，對這6株菌進行耐藥基因PCR擴增，結(jié)果顯示blaCMY、blaCTX-M擴增結(jié)果陽性。對PCR產(chǎn)物進行測序，序列通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)分別與已知的blaCTX-M-55、blaCTX-M-90、blaCMY-2、blaCTX-M-14，blaCTX-M-15，blaCTX-M-27序列100%同源。

表4 不同血清型的沙門氏菌耐藥譜分布
Tab.4 Resistance profile of different serotypes ofSalmonella

耐藥圖譜鼠傷寒火雞印第安納嬰兒湯普遜病牛都柏林腸炎合計全敏-1-1----2TET2------24NAL2-----226TMP1------1TET-NAL2------13TET-CHL1-------1TET-CTX1-------1TET-GEN-1------1NAL-CTX------1-1NAL-GEN-------11TET-CHL-TMP1----1--2TET-CHL-NAL-CTX------1-1TET-GEN-CTX-CIP-TMP1-------1TET-GEN-NAL-CHL-CIP1-------1TET-NAL-CHL-TMP-CIP21------3TET-CTX-GEN-NAL-CIP-----1--1TET-CHL-CIP-NAL-GEN-CTX--1-----1TET-CTX-CFX-CIP-TMP-CHL----1---1TET-GEN-NAL-CHL-TMP-CIP4------15TET-GEN-CTX-CFX-CIP-CHL-----1--1TET-GEN-CTX-CFX-CIP-TMP-CHL1----2--3合計18411154741

注：CIP為環(huán)丙沙星，SXT/TMP為甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，CHL為氯霉素，NAL為萘啶酸，GEN為慶大霉素，TET為四環(huán)素，CTX為頭孢噻肟，CFX為頭孢西丁。

表5 44株沙門氏菌對8種抗生素的耐藥情況
Tab.5 Resistance of 44Salmonellaisolates to 8 antibiotics

藥物名稱耐藥數(shù)n(%)中度敏感數(shù)n(%)敏感數(shù)n(%)環(huán)丙沙星(CIP)17(41.46)18(43.90)6(14.63)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(SXT)16(39.02)-25(60.98)氯霉素(CHL)10(46.34)-22(53.66)萘啶酸(NAL)23(56.10)-18(43.90)慶大霉素(GEN)15(36.59)2(4.88)24(58.54)四環(huán)素(TET)30(73.17)1(2.44)10(24.39)頭孢噻肟(CTX)11(26.83)-30(73.17)頭孢西丁(CFX)5(12.20)9(21.95)27(65.85)

3 討 論

細菌性食源性疾病現(xiàn)在在全世界范圍內(nèi)廣為流行，影響人們的生命安全。而其中沙門氏菌引起的食源性疾病位列首位。早先隨著各種抗生素的廣泛大量使用，包括沙門氏菌在內(nèi)的多種細菌的耐藥性以及耐藥種類一直在增加，并且多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。本研究中沙門氏菌耐藥性，與王茂起等[11]報道的2001年中國食源性致病菌及其耐藥性主動監(jiān)測研究結(jié)果相比，四環(huán)素、萘啶酸均由高敏感性轉(zhuǎn)為高耐藥性，而全部敏感的環(huán)丙沙星和慶大霉素也檢測出耐藥性。另外，本研究中沙門氏菌多重耐藥率較嚴重，超過60%，且發(fā)現(xiàn)6株攜帶不同耐藥基因類型的產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶的鼠傷寒沙門氏菌，產(chǎn)ESBLs菌株比例高于全國平均水平及歐美發(fā)達國家水平(一般平均為3%左右)，具體原因有待進一步研究。其中blaCMY-2及blaCTX-M-55在耐藥沙門氏菌中廣泛存在[12-13]，blaCMY-2還曾經(jīng)在山東泰安的豬上檢測到；雖然blaCTX-M-90在沙門氏菌中少見，但在耐藥嚴重的大腸桿菌及克雷伯菌中常見[14]；blaCTX-M-14，blaCTX-M-27及blaCTX-M-15均在我國不同省份(如河南、北京、上海等)人源耐藥鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌中檢測到[15-16]，同時動物源大腸桿菌及沙門氏菌中也普遍存在上述耐藥基因，而且這些耐藥基因大多可以在不同菌株菌種(包括不同種屬)間水平轉(zhuǎn)移[8]。上述不同耐藥基因型的發(fā)現(xiàn)，提示可能存在耐藥基因或耐藥菌株的污染，以及在動物、環(huán)境及人類之間的擴散，不同地域之間的播散。考慮聊城為山東畜禽主要養(yǎng)殖地區(qū)之一，山東又是全國畜禽養(yǎng)殖大省，密切監(jiān)測人群及動物中耐藥趨勢變化、耐藥變遷、耐藥基因攜帶及轉(zhuǎn)移情況，對于科學合理管控臨床及動物用藥具有重要意義。

血清分型發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為聊城市優(yōu)勢沙門氏菌血清型，這與國內(nèi)及國際其他研究結(jié)果一致。腸炎沙門氏菌是引起我國食物中毒的主要沙門氏菌血清型，聊城市2015年至2017年3年從腹瀉病例中均分離得到腸炎沙門氏菌，分別分離到4株、2株和1株，不同年代不同批次樣本中分離得到此致病菌，說明該地區(qū)腸炎沙門氏菌感染情況不容樂觀，存在著腸炎沙門氏菌污染食品的風險，提示有關(guān)部門應高度重視，并進行溯源追蹤，實時監(jiān)測以避免腸炎沙門氏菌暴發(fā)的風險。但火雞沙門氏菌相對分離率較高，PFGE結(jié)果提示2株火雞沙門氏菌親緣關(guān)系較近(2條帶的差異)，但由于菌株數(shù)量較少，具體原因及感染或污染來源尚待加強監(jiān)測及流行病學調(diào)查進一步查明。此外，沙門氏菌的分離率自2015年至2016年有所增加，在分離方法不變的情況下，可能是由于現(xiàn)在生活條件相對提高，人們外出就餐機會較大，但是外出就餐的食品衛(wèi)生方面無法保證，因此由沙門氏菌引起的感染性腹瀉或食物中毒增多所致。

PFGE至今被公認為細菌特別是沙門氏菌分子流行病學研究的“金標準”[17]，是一種非常有效的分子分型的方法，可用于分析不同來源菌株之間的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)暴發(fā)、識別傳染源(污染源)及推測流行范圍。本研究中沙門氏菌PFGE帶型具有多態(tài)性，未發(fā)現(xiàn)3株(含)以上菌株帶型完全一致的現(xiàn)象，提示無沙門氏菌既往暴發(fā)。但由于分離菌株數(shù)量較少，尚需擴大監(jiān)測范圍，不斷建立并完善菌株及分子分型數(shù)據(jù)庫，為進一步發(fā)現(xiàn)暴發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本研究雖然獲得的沙門氏菌株數(shù)量較少，但沙門氏菌分離率維持在正常水平，說明研究中方法適宜，不會造成結(jié)果的偏移。雖然菌株數(shù)量較少，但耐三代頭孢菌素水平相對較高，且攜帶耐藥基因種類多樣，這是否與山東是食品動物飼養(yǎng)大省及動物中用藥水平較高有關(guān)，尚需進一步研究證明。同時，該研究也為下一步開展動物-食品-人-環(huán)境全鏈條耐藥監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)，提供了線索。

總之，本研究建立了聊城地區(qū)感染性腹瀉患者中沙門氏菌的分子分型數(shù)據(jù)庫，為今后發(fā)現(xiàn)暴發(fā)奠定了基礎(chǔ)。同時發(fā)現(xiàn)該地區(qū)沙門氏菌耐藥現(xiàn)象嚴重，發(fā)現(xiàn)攜帶多種可轉(zhuǎn)移的耐藥基因的產(chǎn)ESBLs的鼠傷寒沙門氏菌，提示耐藥基因或耐藥菌株在該地區(qū)可能存在擴散現(xiàn)象，醫(yī)院應做好衛(wèi)生和環(huán)境日常消毒、終末消毒預防和降低多重耐藥菌的傳播，食藥監(jiān)部門和疾控部門也應加強合作，加大對食品等的綜合檢測力度，為食源性疾病的預防和控制提供數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突：無