奶子藤吲哚生物堿化學成分研究

王亞蘭，張金蘋，王志偉，王曉靜*

1濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南 250200；2山東省醫學科學院藥物研究所，濟南 250062；3山東省分析測試中心 齊魯工業大學(山東省科學院)，濟南 250014；4國家衛生部生物技術藥物重點實驗室 山東省罕少見病重點實驗室，濟南 250062

奶子藤(Bousigoniamekongensis)為夾竹桃科奶子藤屬的植物，主要分布在我國西南地區，具有清火解毒，補氣活血，養顏美容的功效，是傣藥“雅解沙把”(百解膠囊)的重要藥材之一。迄今為止，從奶子藤屬中已分離得到白堅木型、長春曼胺型、依波格型、二聚體及其他類型等5種骨架結構的生物堿類化合物，其中白堅木型和長春曼胺型為主要的結構類型，其生物活性主要為抗腫瘤、抗HIV等[1-6]。目前，國內外對奶子藤的化學成分研究較少，為更好的闡明其藥效物質基礎促進資源的合理開發利用，我們對奶子藤根中的化學成分進行了研究，共分離得到9個化合物，其中化合物1，3～7首次從該屬植物中分離得到，化合物2為首次從該植物中分離得到，并首次對該植物成分進行拮抗高糖所致的足細胞損傷活性和抑制淀粉樣蛋白-β(Aβ)活性測試，且發現化合物6具有一定的Aβ抑制活性(IC50= 26.1 μM)，為奶子藤后續的活性成分研究提供一定的依據。

1 儀器與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance III 400 NMR型核磁共振儀；Agilent Technology 6520 Accurate-Mass Q-TOF型質譜儀；Agilent 1100型高效液相色譜儀；Thermo AcclaimTM120 C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；艾杰爾LC-6AD 制備液相色譜儀(天津)；Daisogel C18制備型色譜柱(20 × 250 mm,10 μm)。

硅膠及高效薄層板(青島海洋化工廠和Merck公司)；ODS-C18(日本YMC公司產品)；分析甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

Aβ(上海優諾生物科技有限公司，分子量4514.14，純度>95%，白色粉末)；1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(六氟異丙醇)和硫代硫黃素T (ThT)(TCI，上海)。

永生小鼠足細胞(MPC5，來源ATCC)；RPMI 1640培養基(Gibco，批號：991030)；胰蛋白酶(Amresco，批號：27250018)；FBS(Thermo Fisher，批號：NVM0344)；MTT(Ameresco，批號：M21128)；DMSO(Solarbio，批號：302A034)；青霉素(Solarbio，批號：119A031)；鏈霉素(Solarbio，批號：423A054)；Na2HPO4·12H2O(南京化學試劑有限公司，批號：090902)；KH2PO4(南京化學試劑有限公司，批號：090922)；NaCl(南京化學試劑有限公司，批號：09060310494)；KCl(南京化學試劑有限公司，批號：060960239)。

奶子藤 (Bousigoniamekongensis)根采自云南省西雙版納州，由中國科學院西雙版納熱帶植物園張順成采集鑒定，樣本(No.BM-20170912)存放于山東省分析測試中心中藥資源可持續利用研究室。

圖1 化合物1～9的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-9

1.2 提取與分離

奶子藤根18 kg，粉碎，用95%乙醇加熱回流提取，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏，加水混懸，以2% HCl調pH至2～3，用二氯甲烷萃取后，用10% NaOH調pH至9～10，以二氯甲烷萃取得總生物堿部位164 g。

將總生物堿部位164 g進行硅膠柱層析，二氯甲烷：甲醇(40∶1～1∶1)梯度洗脫，經HPLC檢測后合并得到8個部位(Fr.C1～Fr.C8)。Fr.C1部位(9.7 g)進一步硅膠柱層析，石油醚：丙酮(20∶1～1∶1)得16個部位(Fr.C1-1～Fr.C1-16)，其中 Fr.C1-3(150 mg)經制備液相色譜，以85%甲醇-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得到化合物1(50 mg，tR44.4 min)。Fr.C1-13(320 mg)經制備液相色譜，以64%甲醇-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得化合物2(30 mg，tR50.7 min)和3(60 mg，tR63.2 min)。Fr.C1-6(140 mg)經制備液相色譜，以62%乙腈-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得化合物4(17 mg，tR94.7 min)。Fr.C1-4(15 mg)經制備液相色譜，以69%甲醇-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得化合物5(5mg，tR50.8 min)。Fr.C1-15(108 mg)經制備液相色譜，以83%甲醇-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得化合物7(20 mg，tR35.1 min)。Fr.C1-11,12(380 mg)經制備液相色譜，以85%甲醇-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得化合物8(30 mg，tR30.7 min)和9(25 mg，tR18.4 min)。Fr.C3部位(21.2 g)經C18-ODS柱層析，以甲醇-水(10%～100%)梯度洗脫得8個部位(Fr.C3-1～Fr.C3-8)，其中Fr.C3-8(200 mg)經制備液相色譜，以95%甲醇-水(含5 mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)洗脫，得化合物6(40 mg，tR15.6 min)。

1.3 拮抗高糖所致的足細胞損傷活性

將接種MCP5細胞后的96孔板置于5% CO2、33 ℃恒溫培養箱中培養，采用RPMI-1640培養基(含10% FBS、10 U/ml IFNγ)培養。待細胞生長至90%融合時，換用含10% FBS RPMI-1640培養基(無IFNγ)培養10天使細胞分化。分化后細胞用于后續實驗。將分化后細胞分為以下三組：(1)空白對照組：葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的RPMI-1640培養基培養；(2)模型對照組：用葡萄糖濃度為33 mmol/L的RPMI-1640培養基培養；(3)給藥組：用葡萄糖濃度為33 mmol/L的RPMI-1640培養基培養的同時給予不同濃度的藥液。陽性對照為黃芪甲苷[7,8]。

1.4 抑制Aβ活性

稱取適量Aβ溶解于六氟異丙醇中，超聲充分溶解后，放置通風櫥中過夜，揮發掉六氟異丙醇，第二天抽真空進一步除去六氟異丙醇，并溶解于60 mM 氫氧化鈉溶液中，配制成2.5 mM Aβ溶液，測定時用PBS(pH7.4)稀釋到25 μM，然后吸取50 μL加入黑色酶標板中，加入等量不同濃度的樣品溶液和5 μM ThT溶液100 μL，在4 ℃下孵育15 min，然后加入體積比為1%的六氟異丙醇誘導Aβ聚集，在激發波長440 nm和吸收波長495 nm下測定25 min中熒光強度變化，計算抑制率，并進一步根據樣品濃度及酶活力計算化合物的IC50。陽性對照為槲皮素[9]。

2 實驗結果

2.1 化合物結構鑒定

化合物1淡黃色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z283 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)譜顯示有1個與氮相連的氫信號δH7.68(1H，s，NH)；4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.47(1H，d，J= 7.2 Hz，H-9)，7.26(1H，d，J= 7.2 Hz，H-12)，7.07(2H，overlapped，H-10，11)；1個甲基信號δH0.84(3H，t，J= 7.6 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)譜顯示有8個烯碳信號δC139.9(C-2)，134.8(C-3)，129.0(C-8)，120.2(C-11)，118.7(C-10)，117.4(C-9)，110.0(C-12)，108.7(C-7)；3個連氧或氮原子的碳信號δC56.7(C-21)，55.1(C-3)，53.3(C-5)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，故確定化合物1為quebrachamine。

化合物2白色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z297 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)譜顯示有4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.51(1H，d，J= 7.6 Hz，H-12)，7.41(1H，J= 8.0 Hz，H-9)，7.20(1H，t，J= 6.8 Hz，H-11)，7.15(1H，t，J= 7.2 Hz，H-10)；1個連接氮或氧的信號δH6.06(1H，d，J= 6.0 Hz，H-16)；1個甲基信號δH0.94(3H，t，J= 7.6 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)譜8個烯碳信號δC134.8(C-13)，131.0(C-2，weak)，128.9(C-8)，121.3(C-11)，120.2(C-10)，118.5(C-9)，109.8(C-12)，105.6(C-7)；4個連氧或氮原子的碳信號δC74.7(C-16)，59.3(C-21)，51.4(C-5)，44.9(C-3)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故確定化合物2為(-)-isoeburnamine。

化合物3淡黃色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示其為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z295 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)譜顯示有1個與氮相連的氫信號δH6.58(1H，s，NH)；4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.43(1H，d，J= 6.8 Hz，H-9)，7.35(1H，t，J= 6.8 Hz，H-10)，7.30(1H，t，J= 7.2 Hz，H-11)，7.21(1H，d，J= 7.2 Hz，H-12)；2個烯氫信號δH6.51(1H，brs，H-5)，5.76(1H，brs，H-6)；1個甲基信號δH0.72(3H，t，J= 7.2 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)譜顯示有1個羰基信號δC177.3(C-2)；10個烯碳信號δC140.4(C-13)，138.1(C-8)，131.4(C-9)，130.6(C-21)，128.0(C-10)，127.2(C-11)，126.8(C-12)，119.2(C-5)，117.3(C-7)，109.6(C-6)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故確定化合物3為rhazinilam。

化合物4淡黃色無定形粉末(氯仿、甲醇)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z353 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)顯示有1個與氮原子相連的氫信號δH8.06(1H，brs，NH)；4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.45(1H，d，J= 7.2 Hz，H-9)，7.28(1H，d，J= 7.2 Hz，H-12)，7.12(1H，t，J= 6.8 Hz，H-11)，7.07(1H，t，J= 6.8 Hz，H-10)；1個烯氫信號δH7.56(1H，s，H-17)；1個甲氧基信號δH3.75(3H，s，OMe-23)；1個雙峰甲基信號δH1.40(3H，d，J= 6.0 Hz，Me-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)顯示有1個酯羰基信號δC168.0(C-22)；10個烯碳信號δC134.6(C-2)，108.0(C-7)，127.2(C-8)，118.0(C-9)，119.3(C-10)，121.3(C-11)，110.8(C-12)，136.1(C-13)，109.6(C-16)，155.8(C-17)；5個連氧或氮的碳信號δC59.9(C-3)，53.6(C-5)，72.5(C-19)，56.3(C-21)，51.1(C-23)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故確定化合物4為tetrahydroalstonine。

化合物5淡黃色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示其為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z297 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)顯示有4個吲哚環上的芳香氫信號δH8.10(1H，d，J= 8.0 Hz，H-12)，7.16(1H，t，J= 7.6 Hz，H-11)，7.13(1H，d，J= 7.6 Hz，H-9)，6.99(1H，t，J= 7.6 Hz，H-10)；1個甲基信號δH0.72(3H，t，J= 7.6 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)顯示有1個羰基碳信號δC172.9(C-2)；6個烯碳信號δC143.0(C-13)，133.9(C-8)，127.5(C-9)，123.6(C-10)，123.5(C-11)，114.4(C-12)；3個連氧或氮原子的碳信號δC97.6(C-21)，52.3(C-5)，50.9(C-3)。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故確定化合物5為leuconodine D。

化合物6淡黃色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z573 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)顯示有6個吲哚環上的芳香氫及烯氫信號δH7.71(1H，brs，H-12)，7.42(1H，brs，H-9)，7.38(1H，brs，H-9′)，6.90(1H，brs，H-10′)，6.74(1H，brs，H-11′)，6.61(1H，brs，H-12′)；3個烯氫信號δH6.39(1H，brs，H-6)，5.21和4.73(each1H，brs，H-5)；2個甲基信號δH0.78(3H，s，H-18′)，0.66(3H，s，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)顯示有19個烯碳信號δC160.8(C-2)，155.8(C-11)，147.4(C-13)，143.8(C-7)，136.2(C-13′)，133.8(C-2′)，131.2(C-6)，130.9(C-8)，128.5(C-8′)，123.6(C-9)，123.1(C-5)，121.0(C-16)，120.3(C-11′)，119.0(C-10′)，118.9(C-10)，117.8(C-9′)，112.5(C-12′)，110.5(C-12)，104.6(C-7′)；6個連氧或氮的碳信號δC59.4(C-21′)，57.4(C-21)，55.6(C-3)，50.7(C-5′)，49.7(C-16′)，44.4(C-3′)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故確定化合物6為leucophyllidine。

化合物7白色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z325 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)顯示有4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.60(1H，d，J= 7.6 Hz，H-12)，7.48(1H，d，J= 7.2 Hz，H-9)，7.18(1H，t，J= 6.4 Hz，H-11)，7.14(1H，t，J= 7.2 Hz，H-10)，2個連接氮或氧的信號δH5.55(1H，dd，J= 9.4，5.2 Hz，H-16)，3.92(1H，s，H-21)，1個甲基信號δH0.93(3H，t，J= 7.6 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)顯示有8個烯碳信號δC136.7(C-13)，133.0(C-2)，128.7(C-8)，121.3(C-11)，120.0(C-10)，118.0(C-9)，111.9(C-12)，105.7(C-7)；5個連氧或氮原子的碳信號δC81.9(C-16)，59.1(MeCH2O-)，58.9(C-21)，50.9(C-5)，44.3(C-3)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故確定化合物7為(-)-O-ethyleburnamine。

化合物8白色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示其為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z279 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)顯示有4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.34(1H，d，J= 7.2 Hz，H-9)，7.20(1H，d，J= 7.6 Hz，H-12)，7.06(1H，t，J= 7.2 Hz，H-11)，6.98(1H，t，J= 6.8 Hz，H-10)；2個烯氫信號δH6.79(1H，d，J= 7.6 Hz，H-16)，4.95(1H，d，J= 7.2 Hz，H-17)；1個連接氮或氧的信號δH4.14(1H，s，H-21)；1個甲基信號δH0.87(3H，t，J= 6.8 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)顯示有10個烯碳信號δc 133.6(C-13)，130.3(C-2)，128.3(C-8)，121.6(C-10)，119.9(C-11)，119.8(C-16)，118.4(C-9)，116.8(C-12)，108.5(C-17)，107.1(C-7)；3個連氧或氮原子的碳信號δC55.9(C-21)，52.2(C-5)，45.5(C-3)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故確定化合物8為(-)-eburnamenine。

化合物9白色無定形粉末(氯仿、丙酮)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z281 [M+H]+。1H NMR(CDCl3，400 MHz)顯示有4個吲哚環上的芳香氫信號δH7.51(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，7.33(1H，d，J= 7.2 Hz，H-12)，7.29(1H，t，J= 7.6 Hz，H-11)，7.16(1H，t，J= 7.6 Hz，H-10)，1個甲基信號δH0.49(3H，t，J= 7.6 Hz，H-18)。13C NMR(CDCl3，100 MHz)顯示有7個烯碳信號δC192.4(C-2)，154.6(C-13)，147.2(C-8)，127.5(C-11)，125.1(C-10)，121.0(C-9)，120.1(C-12)；3個連氧或氮原子的碳信號δC79.0(C-21)，54.6(C-5)，52.0(C-3)。以上數據與文獻[3]報道基本一致，故確定化合物9為eburenine。

2.2 拮抗高糖所致的足細胞損傷活性結果

結果顯示，化合物1～9在50 μM給藥濃度下，未顯示拮抗高糖所致的足細胞損傷活性(陽性對照黃芪甲苷的EC50= 15.4 μM)。

2.3 抑制Aβ活性結果

結果顯示，化合物6具有一定的Aβ抑制活性，其IC50為26.1 μM (陽性對照槲皮素的IC50= 6.09 μM)，其他化合物無明顯的Aβ抑制活性。

3 結論

本文對奶子藤的根進行了化學成分研究，分離得到9個單萜吲哚生物堿類化合物，其中化合物6為雙吲哚生物堿成分，其中化合物1，3～7為首次從該屬植物中分離得到，化合物2為首次從該植物中分離得到。對分離得到的9個化合物進行了拮抗高糖所致的足細胞損傷活性及Aβ抑制活性評價，結果顯示，化合物6具有一定的Aβ抑制活性，IC50為26.1 μM(陽性對照槲皮素的IC50= 6.09 μM)。目前，國內外對奶子藤屬植物的化學成分研究較少，本研究豐富了該屬植物化學結構的多樣性。