聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯生物降解膜對土壤氨氧化和反硝化微生物變化的影響

林 青，曾 軍，王 斌，史應(yīng)武，楊紅梅，張 濤，高 雁，楚 敏，王金鑫，孫九勝，霍向東

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】 聚乙烯地膜具有防除雜草、保墑、增溫、提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)等作用且價格低廉，我國已成為世界上地膜用量最多、覆蓋面積最大、覆蓋作物種類最多的國家[1]。傳統(tǒng)聚乙烯地膜在自然環(huán)境中極其不易被分解，伴隨著地膜覆蓋使用年限的增加和殘膜回收率低土壤中殘膜量逐步增加，已造成嚴重的白色污染[2,3]。可降解地膜已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量應(yīng)用，已成為傳統(tǒng)地膜的理想替代品[4-6]?！厩叭搜芯窟M展】趙彩霞[1]、唐薇[8]、朱友娟等[9]研究表明，一些生物降解地膜產(chǎn)品與傳統(tǒng)地膜在增溫、保墑及棉花產(chǎn)量方面的差異不顯著。胡宏亮[10]、石鳳興等[11]研究表明，部分生物降解膜的保溫性能接近普通地膜，且在作物生長發(fā)育與產(chǎn)量方面優(yōu)于普通地膜。林萌萌等[12]研究表明，部分生物降解地膜能達到與普通地膜相似的保溫保墑效果，在提高葉綠素含量，葉片凈光合速率，延緩葉片衰老方面優(yōu)于普通地膜處理。Touchaleaume[13]研究顯示四種PBAT生物降解膜與PE膜相比，葡萄藤生長量和葡萄產(chǎn)量沒有顯著差異。氨氧化作用是土壤硝化作用的限速步驟，是氮循環(huán)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié),氨氧化過程的產(chǎn)物硝酸鹽通過反硝化作用還原為一系列氮氧化氣體和氮氣，進而導(dǎo)致土壤氮素的損失及溫室氣體排放增加。地膜覆蓋對土壤耕層氮素含量的增加及減少N2O的排放具有積極作用[14,15]?！颈狙芯壳腥朦c】PBAT生物降解膜對土壤中氮循環(huán)相關(guān)微生物的影響不是十分清楚。研究聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯生物降解膜對土壤理化性質(zhì)及氮循環(huán)相關(guān)微生物的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究氨氧化細菌和氨氧化古菌(amoA基因)及反硝化(nosZ基因)功能微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，分析PBAT生物降解膜對土壤中氮循環(huán)微生物的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院拜城試驗站鋪覆(Polyethylene)PE膜(市售)和PBAT生物降解膜(新疆康潤潔環(huán)保科技有限公司)的番茄、玉米、甜菜、花生、馬鈴薯。以及岳普湖縣岳普湖鄉(xiāng)鋪覆PE膜和PBAT生物降解膜的棉花各667 m2，在作物收獲前且兩種薄膜都有破損的情況下每個處理3點土柱法采集0～30 cm耕作層土，新鮮土樣冷藏運回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.2 方 法

1.2.1 土壤基本理化性質(zhì)1.2.2 土壤DNA提取和實時定量PCR

稱取0.5 g新鮮土樣，按照PowerSoilTM試劑盒(MoBio Laboratories)方法,提取土壤DNA，100 uL洗脫，Epoch微量測定DNA的濃度和純度。DNA樣品存儲在-20℃，用作下游分子實驗的模板。 AOA-amoA、AOB-amoA 和nosZ 基因的定量測定在LightCycler? 480熒光實時定量PCR儀(Roche Diagnostics Ltd.Switzerland)上完成，列出使用的引物和擴增條件。 采用SYBR GREEN作為熒光標記，反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2X TB Green Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara Biotechnolgy，Japan)，模板DNA 2 μL，引物各0.4 μL(10 μM)，其余用滅菌雙蒸水補足。用于標準曲線的質(zhì)粒制備和提取參照之前文獻中發(fā)表的方法[16]，10倍連續(xù)稀釋的質(zhì)粒用于構(gòu)建定量PCR標準曲線，所有基因的擴增效率均保證在85%～98%，利用溶解曲線檢測擴增的特異性。表1

表1 PCR所用的引物序列和反應(yīng)條件
Table 1 Primer sequences and reaction conditions used by PCR

amoA-1F+amoA417R用于AOA-amoA基因，nosZ-F+nosZ2R用于nosZ基因的T-RFLP分析

1.2.3 末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)

末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal restrictiction fragment length polymorphism,T-RFLP)利用6-carboxyfluorescein(FAM)熒光標記正向引物的5’末端，目標基因經(jīng)PCR擴增后被標記，選取適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切后產(chǎn)生長度不等的DNA片段，經(jīng)毛細管電泳分離，熒光檢測后產(chǎn)生不同長度大小及熒光強度的圖譜，通過對不同樣品圖譜間波峰的比較，可得到各功能基因群落結(jié)構(gòu)和多樣性在處理間的差異[17，18]。土壤DNA的PCR擴增采用表1所列引物，其中FAM熒光標記引物用于T-RFLP的研究。PCR產(chǎn)物用Wizard SV Gel and PCR Clean純化試劑盒(Promega，USA)純化。AOA-amoA和nosZ基因采用的內(nèi)切酶是HhaⅠ(Takara Biotechnology，Japan)，AOB-amoA基因采用內(nèi)切酶MspⅠ(Takara Biotechnology，Japan)[19，20]。 反應(yīng)體系為20 μL，包括酶(4U)和DNA樣品(約500 ng)，在37℃酶切3 h。 反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 PBAT可降解膜與PE膜對土壤理化性質(zhì)的影響

研究表明，在鋪覆的地膜崩解期，同種作物(除棉花外，棉花兩種鋪覆實驗地基礎(chǔ)條件差異較大)鋪覆PBAT生物降解膜與PE膜的土壤pH、總鹽、有機質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀等理化性質(zhì)之間。表2

表2 鋪覆PBAT可降解膜與PE膜土壤的理化性質(zhì)
Table 2 Physical and chemical properties of coated PBAT degradable membrane and PE membrane soil

處理TreatmentpH總鹽Totalsalt(g/kg)有機質(zhì)Organicmatter(g/kg)速效氮Availablenitrogen(mg/kg)速效磷Availablephosphors(mg/kg)速效鉀Availablepotassium(mg/kg)含水量Watercontent(%)番茄PE(T.PE)8.222.35.29103.752.020315.76番茄PBAT(T.PBAT)8.212.05.0797.442.218314.91玉米PE(C.PE)8.012.74.90118.761.720617.37玉米PBAT(C.PBAT)7.994.04.39161.340.320116.14甜菜PE(Sb.PE)7.962.26.21184.2152.022317.71甜菜PBAT(Sb.PBAT)7.952.36.44172.4183.322811.56花生PE(Pn.PE)7.883.25.40154.2176.627712.99花生PBAT(Pn.PBAT)8.022.96.06146.3176.229612.58土豆PE(P.PE)7.962.84.75144.0115.917414.38土豆PBAT(P.PBAT)8.013.05.14145.6125.418213.39棉花PE(Cot.PE)8.309.57.1734.7318.79018.39棉花PBAT(Cot.PBAT)8.601.76.8866.5312.76918.06

注：番茄PE(tomato PE,T.PE),番茄PBAT(tomato PBAT,T.PBAT);玉米PE(corn PE,C.PE),玉米PBAT(corn PBAT,C.PBAT);甜菜PE(sugar beet PE,Sb.PE),甜菜PBAT(sugar beet PBAT,Sb.PBAT);花生PE(peanut PE,Pn.PE),花生PBAT(peanut PBAT,Pn.PBAT);土豆PE(potato PE,P.PE),土豆PBAT(potato PBAT,P.PBAT);棉花PE(cotton PE,Cot.PE),棉花PBAT(cotton PBAT,Cot.PBAT)。下同(the same as below)

2.2 PBAT可降解膜與PE膜對氨氧化和反硝化功能基因豐度的影響

研究表明， AOA-amoA基因擴增效率為86%，AOB-amoA基因的擴增效率為95%，nosZ基因擴增效率為95%。實時熒光定量PCR測定六種作物鋪覆兩種不同薄膜情況下的土壤古菌氨氧化基因AOA-amoA、細菌氨氧化基因AOB-amoA及反硝化微生物nosZ基因的豐度。AOA-amoA基因豐度范圍為每克干土(1.56×107～1.04×109)，其中番茄鋪覆PE膜的基因豐度最高，棉花鋪覆PBAT生物降解膜的基因豐度最低。AOB-amoA基因豐度范圍為每克干土(2.15×106～2.20×109)，其中花生鋪覆PBAT生物降解膜的基因豐度最高，棉花鋪覆PE膜的基因豐度最低。nosZ基因豐度范圍為每克干土(1.38×105～5.56×106)，其中番茄鋪覆PBAT生物降解膜的基因豐度最高，花生鋪覆PE膜的基因豐度最低。實驗結(jié)果表明,同種作物鋪覆PBAT生物降解膜與PE膜之間，AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因豐度無顯著差異，而不同作物對AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因豐度的影響較為明顯。圖1

注：(A) 古菌氨氧化基因豐度；(B) 細菌氨氧化基因豐度；(C)氧化亞氮還原酶基因的豐度

(A) AOA-amoA gene abundance; (B) AOB-amoA gene abundance; (C) nosZ genes abundance

圖1 古菌氨氧化基因、細菌氨氧化基因及反硝化微生物nosZ基因的拷貝數(shù)
Fig.1 Gene copy numbers of the AOA-amoA, AOB-amoA and nosZ.

2.3 PBAT可降解膜與PE膜對氨氧化和反硝化功能基因多樣性的影響

研究表明，土壤AOA-amoA基因經(jīng)過HhaⅠ酶切后，選取相對峰面積大于0.01的限制性末端片段(T-RFs)作為7個優(yōu)勢片段(A)，其中165、332、546、602和641 bp 5個T-RFs為拜城試驗站5種作物的優(yōu)勢片段，546 bp的平均相對豐度達67.5%。而165、256、267和641 bp 4個T-RFs為岳普湖鄉(xiāng)棉花的優(yōu)勢片段，256和267 bp為特有片段，641 bp的平均相對豐度高達89.7%。土壤AOB-amoA基因經(jīng)過MspⅠ酶切后，得到相對峰面積大于0.01的 3個T-RFs分別為54、233和254 bp，為6種作物共有的優(yōu)勢片段(B)。其中233 bp為拜城試驗站5種作物土壤的主要片段，其平均豐度達59.9%，而54 bp為岳普湖鄉(xiāng)棉花的主要片段，平均豐度達82.5%。6種作物土壤的nosZ基因經(jīng)過HhaⅠ酶切后得到5個相對峰面積大于0.01的優(yōu)勢片段T-RFs(C)。其中352 bp為拜城試驗站5種作物土壤的主要片段，其平均豐度達41.5%，而50 bp為岳普湖鄉(xiāng)棉花的主要片段，平均豐度達22.1%。

T-RFLP指紋圖譜的解析中，在特定引物和內(nèi)切酶的組合下，每一個T-RF可代表一個物種，氨氧化細菌和氨氧化古菌(amoA基因)及反硝化(nosZ基因)功能微生物在不同群落中的組成及比例的差異主要體現(xiàn)在作物品種和種植地域之間，而在鋪覆PBAT生物降解膜和PE膜間沒有顯著差異。圖2

圖2 不同作物在鋪覆PBAT生物降解膜和PE膜下土壤AOA-amoA(A)、AOB-amoA(B)和nosZ(C) 基因 T-RFs相對豐度
Fig.2 Relative abundance of T-RFs of AOA-amoA(A), AOB-amoA(B) and nosZ(C) in different crops under PE and PBAT membrane

將6種作物鋪覆不同膜土壤中的氨氧化細菌、氨氧化古菌和反硝化功能微生物的群落多樣性指數(shù)對比發(fā)現(xiàn)：在不同作物土壤中氨氧化古菌種類最為豐富，其群落的物種豐度S最高，在花生PBAT土壤中高達35.33，而氨氧化細菌群落最低，范圍在2.67～7.33。多樣性指數(shù)Shannon-Weiner指數(shù)H，Simpson指數(shù)D和物種均度E，在6種作物PBAT生物降解膜和PE膜之間較為均勻，差異不顯著。與優(yōu)勢片段的群落特征類似，即4個多樣性指數(shù)在作物品種間、種植地域間呈顯著差異，而在鋪覆不同地膜間無顯著差異。表3

表3 不同作物在鋪覆PBAT生物降解膜和PE膜下土壤AOA-amoA(A)、AOB-amoA(B)和nosZ(C) 基因多樣性指數(shù)
Table 3 Diversity indices of AOA-amoA(A), AOB-amoA(B) and nosZ(C) in 6 crops under PE and PBAT membrane

處理Treatment氨氧化古菌Ammonia-oxidizingarchaea氨氧化細菌Ammonia-oxidizingbacteria反硝化微生物DenitrifyingmicrobiaSH'DESH'DESH'DE番茄PE8.671.020.530.487.331.200.570.637.331.730.780.94番茄PBAT20.331.130.540.416.001.040.500.599.001.890.790.93玉米PE17.001.010.470.362.670.550.300.5614.332.480.570.94玉米PBAT15.331.040.540.395.000.920.460.5714.002.370.890.90甜菜PE33.331.020.380.295.331.030.550.6212.332.270.870.91甜菜PBAT28.000.730.240.224.330.910.520.6710.001.930.780.85花生PE30.671.280.560.373.000.780.470.7114.002.360.880.90花生PBAT35.331.400.610.393.670.880.510.6913.672.390.890.92土豆PE26.671.160.540.384.001.010.560.7412.672.270.880.90土豆PBAT11.001.060.510.483.000.760.450.6913.672.290.870.91棉花PE6.330.720.320.396.501.100.490.589.672.010.830.89棉花PBAT9.501.270.520.546.500.830.360.4412.002.190.860.88

3 討 論

土壤中的氨氧化和反硝化微生物是氮素轉(zhuǎn)化功能的重要參與者，其數(shù)量和多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)密切相關(guān)。地膜覆蓋會改變土壤的氮素循環(huán)過程，明顯加速氮礦化速率，增加土壤氮素的含量[14，21，22]。張景俊等[23]研究顯示,地膜覆蓋僅對0～40 cm土層硝態(tài)氮有影響，覆膜120 d后,普通塑料地膜覆蓋與生物可降解地膜覆蓋處理差異逐漸變大。但研究中，崩解期同種作物鋪覆PBAT生物降解膜與PE膜之間的土壤各理化指標差異不顯著。不同生物降解膜與PE膜崩解的時間的差異可能是造成研究與已有研究結(jié)果不同的原因。尚書研究顯示不覆膜、半覆膜和全覆膜三種覆膜方式對土壤中氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度有一定的影響[24]。研究中，同種作物鋪覆PBAT生物降解膜與PE膜之間，AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因豐度與多樣性無顯著差異，但不同作物對AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因豐度的影響較為明顯。這與日本Akihiko Masui等[25]的研究結(jié)果：丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)和聚已酸內(nèi)酯(PCL) 降解膜與PE膜對土壤細菌總量、細菌群落結(jié)構(gòu)影響無差異，相一致。Anu Kapanen等[26]的研究結(jié)果也顯示生物降解膜與PE膜對土壤中氨氧化細菌的群落多樣性影響無差異。

4 結(jié) 論

通過對番茄等6種作物分別鋪覆PBAT生物降解膜與PE膜后，測定了其土壤理化性質(zhì)，用實時熒光定量和T-RFLP指紋圖譜技術(shù)分析了土壤中重要的氮元素循環(huán)相關(guān)的氨氧化細菌、氨氧化古菌(amoA基因)和反硝化(nosZ基因)功能微生物的群落豐度、群落結(jié)構(gòu)及多樣性。結(jié)果表明，PBAT生物降解膜與PE膜對土壤理化性質(zhì)、3種功能微生物的群落豐度、結(jié)構(gòu)及多樣性的影響無顯著差異(P>0.05)，而作物的種類是造成差異的主要因素，即鋪覆PBAT生物降解膜和PE膜不會對同種作物的土壤重要理化性質(zhì)和氮循環(huán)相關(guān)功能微生物的群落產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)。基于PE膜造成的嚴重白色污染，可以考慮用PBAT生物降解膜替代傳統(tǒng)PE膜。