馬鈴薯甲蟲RNA干擾高效致死基因的篩選

米熱古麗·胡爾西達，付開赟，徐晴玉，吐爾遜·艾合買提，丁新華，何 江，郭文超

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；3. 新疆農業大學博士后流動站，新疆農業科學院博士后工作站，烏魯木齊 830052;4.南京農業大學植物保護學院，南京 210095；5.新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)是馬鈴薯上國際檢疫的食葉毀滅性害蟲[1]。馬鈴薯甲蟲是世界上應用化學防治最早、最為廣泛的害蟲，也是最早產生抗藥性的害蟲之一。到目前為止馬鈴薯甲蟲對所有已注冊的化學農藥均產生了抗藥性[2]。RNA干擾現象在1998年發現以來[3]，逐步應用于基因功能研究、基因檢測和醫療領域[4]，在昆蟲領域中雖然RNAi技術尚無應用于田間害蟲防治的產品，但其綠色無公害，專一性強，作為“基因農藥”是最具潛力的害蟲防治手段之一。研究通過篩選更為快速高效的馬鈴薯甲蟲致死基因，針對性提高RNAi效力，為RNAi防控技術能更好的應用田間提供了理論和技術支持。【前人研究進展】RNA干擾研究的昆蟲種類已達幾十種，包括鱗翅目、直翅目、膜翅目、同翅目、雙翅目等多種昆蟲[5-9]。通過注射或喂食dsRNA的方法比較發現組織器官的差異、物種的差別、基因的選擇對RNA干擾效果影響較大[5]。先前研究通過dsRNA原核表達系統研究了馬鈴薯甲蟲ATP酶E亞基的致死效果。結果表明，四齡幼蟲的化蛹致死中濃度為dsATPaseE表達菌液的0.001 2倍，處理高濃度的dsATPaseE的幼蟲均會在處理后3 d 出現拒食表型，在較高濃度處理下的馬鈴薯甲蟲幼蟲行動力下降，全部不能入土化蛹，在適中的濃度處理下的馬鈴薯甲蟲能夠入土，但是在土中全部不能正常化蛹[10]。【本研究切入點】研究利用赤擬谷盜中報導的高效快速致死基因[11]，以dsATPaseE和dsATPaseA為對照基因，初步建立高效致死基因的評價方法，鑒定分析馬鈴薯甲蟲中快速高效的RNA干擾靶標基因。【擬解決的關鍵問題】研究RNA干擾技術篩選高效致死基因，提出高效致死基因的關鍵評價指標。總結RNA干擾鞘翅目中兩種昆蟲的直系同源基因的試驗結果，分析RNA干擾致死率的差異造成的原因。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲

馬鈴薯甲蟲卵塊均隨機采集于新疆農科院植物保護研究所安寧渠試驗地。(N：43.9128，E：87.4918)。培養箱飼養溫度：(26±1)℃；光周期：14L∶10D；相對濕度50%～60%。用新鮮馬鈴薯葉片飼喂，取同一時間蛻皮至2齡初的幼蟲作實驗用蟲。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑(TRIzol)購自Invitrogen公司，引物合成購自南京金斯瑞公司、SuperScript III反轉錄酶、Oligo (dT)18隨機引物、TaqDNA聚合酶、dNTP mixture (2.5 mM 和10 mM) RNase抑制劑、DNA Marker購自TaKaRa寶生物公司。pGEM-T easy vector購自Promega公司。DNA凝膠回收試劑盒為AXYGEN公司或Promega公司產品；感受態細胞購自北京全式金公司；其他試劑為國產AR級或進口產品如酵母提取液和胰蛋白胨為Oxiod公司產品。

利用相似性搜索工具BLAST-2.2.27+，在馬鈴薯甲蟲的轉錄組和基因組中(轉錄組數據由南京農業大學李國清老師惠贈，馬鈴薯甲蟲的基因組數據下載自美國貝勒醫學院人類基因組測序中心網站https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/colorado-potato-beetle-genome-Project。)搜索在赤擬谷盜中報導的40個高效致死基因[5]。選定赤擬谷盜致死基因中致死效率最高的10個基因，分別為Tcpp1alpha-96a、TcRpt3、Tcalphasnap、TcSrp54k、TcRpn6、TcRop、TcGawky、Tcshi、Tccact、Tcinr-a，以及比較致死效率的2個馬鈴薯甲蟲陽性對照基因LdATPaseE和LdATPaseA，獲得的cDNA序列通過PCR驗證序列的正確性后提交到Genbank獲取登錄號。

1.2 方 法

1.2.1 dsRNA原核表達載體的構建

實驗用大腸桿菌EscherichiacoliHTl15(DE3) RNase Ⅲ缺失品系和南京農業大學惠贈的pET-2p dsRNA表達載體。載體構建方法參照[12]中記載方法，用于構建馬鈴薯甲蟲致死基因Tcpp1alpha-96a、TcRpt3、Tcalphasnap、TcSrp54k、TcRpn6、TcRop、TcGawky、Tcshi、Tccact、Tccpf的dsRNA的cDNA片段，超純水和dsegfp為對照，PCR克隆獲得。PCR產物的回收與純化、連接和轉化及單克隆的挑選參照[13]中記載方法。獲得的陽性克隆通過測序和異丙基硫代半乳糖(isopropyl-D-hiogalactoside，IPTG)誘導發酵dsRNA驗證結果。誘導發酵的步驟參照[14]中記載方法，在菌液重新擴大培養至OD600=1.0時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，發酵表達6 h即可獲得穩定表達的濃度約為0.05 μg/μL 的dsRNA[14]。采用 Premier Primer5.0設計dsRNA片段的引物。表1

表1 用于構建dsRNA原核表達載體的引物
Table 1 Primers used for dsRNA synthesis

代號Symbol基因名GeneName上游引物Forwardprimer(5′-3′)下游引物Reverseprimer(5′-3′)dsRNA片段長度LengthofdsRNAfragmentL1Ldalpha-snapTTCGGTAGTTCTAGTCGTAATAGTCTGGTGGTGCTT288L2LdcactGAGGGTTGCTCAGGGTATTTCGCTGTCTTCAGTATCG222L3Ldinr-aAGCTCGTTCCTTCGCTAGGCAGTCCTTTGCCCTAAC226L4LdGawkyCGGCTCAAGTTGTCGTTCTGAGGTCGTCAGATAGTTCG224L5LdRpn6GATAAAGATAATGCCGTGAGGTGTAGCGGACAAATGCT323L6LdshiCGTTTACGGGAAGTAGTGGAACCTTTGCGAATGACCT217L7Ldsrp54kAGGAGCGTATGACCAAGTTCAGGTTTCACAGCGTTA219L8LdropCAAGAACACTGCGTTTAGCTTATGCTGTCTGGGATT178L9LdRpt3GGTCCACTACAGGTTCCAGTCCATACATCAACACCC309L10LdpplaphaGCAGAAGTCGTAGGGAAATAACTGACATCATCGCACC171L11LdATPaseAGCGGAAGTAGTAATAATGGGACAACTGATAAGCACCTA197L12LdATPaseEAATCCTGGAAAGCCTCATCCAACTGCTGCGAAATCA281dsegfpdsegfpAAGTTCAGCGTGTCCGCTTGCCGTAGTTCCAC414

1.2.2 喂食dsRNA試驗

將已經構建好的pET-2p-alpha-snap、pET-2p-cact、pET-2p-inr、pET-2p-Gawky、pET-2p-Rpn6、pET-2p-shi、pET-2p-srp54k、pET-2p-rop、pET-2p-rpt、pET-2p-pplapha、pET-2p-ATPaseA、pET-2p-ATPaseE、pET-2p-egfp的大腸桿菌表達載體在含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中以體積比1∶100的比例擴大培養，于37℃ 220 r/min 條件下震蕩培養3.5 h，即OD100=1.0時，按1∶1 000比例(v/v)添加已經配好的IPTG母液(母液濃度0.023 8 g/mL)，至終濃度為0.1 mmol /L，繼續恒溫震蕩4～5 h，以此過程獲得新鮮dsRNA，dsRNA濃度約為50 μg /mL。選取飼養一致的2齡初的幼蟲，分別設置超純水與表達dsegfp稀釋10倍菌液即濃度5 μg / mL為空白對照和陰性對照。將馬鈴薯甲蟲二齡幼蟲置于9 cm標準玻璃皿中，用菌液處理過的葉片進行飼喂。各處理濃度為50、5、0.5和0.05 μg / mL，每個處理5頭幼蟲，6組生物學重復。共計用蟲1 500頭。干擾24 h后喂食新鮮葉片。觀察記錄幼蟲生長狀況、取食率、死亡率。當幼蟲出現化蛹跡象，將其轉入土壤深度為10 cm的封閉環境中，觀察化蛹率。

1.3 數據處理

研究數據處理采用Microsoft Excel、IBM spss statistics 20.0處理，做線性回歸分析模型以及計算取食20%劑量AD20，化蛹中量PD50和致死中量LD50。存活率、化蛹率和羽化率通過ANOVA的Tukey-Kramer分析進行統計檢驗，顯著性水平選擇P<0.05。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯甲蟲幼蟲致死基因的序列信息

選定的10個基因，分別參與不同的生物學功能，其中L1為參與細胞間的粘合；L2參與Toll免疫信號通路；L3為mRNA前體剪切體復合體2蛋白Pcf11，參與mRNA的剪切；L4為三核苷酸重復蛋白，參與miRNA的調節；L5、L9參與蛋白酶體的構成；L6為GTP酶，參與細胞內吞；L7參與細胞膜上的信號識別；L8參與突觸信號的轉導；L10為絲/蘇氨酸磷酸酯酶。對每個基因設計了dsRNA，dsRNA引物及序列長度。表2

表2 馬鈴薯甲蟲致死基因序列信息Table 2 Information
Table of Lethal Genes ofLeptinotarsadecemlineata

代號Symbol基因庫登錄號GenbankAccessionNo蛋白質長度AALength黑腹果蠅直系同源基因OhthologiesinDrosophilamelanogasterE值Evalue一致率IdentityNr數據庫最佳匹配的注釋AnnotationofbesthitinNrDatabaseL1KY285070291CG662500.96PREDICTED:alpha-solubleNSFattachmentprotein[Anoplophoraglabripenn]L2KY285067365CG58483E-1170.53PREDICTED:NF-kappa-Binhibitorcactus-like[Anoplophoraglabripennis]L3KY2850691603CG1022800.5PREDICTED:pre-mRNAcleavagecomplex2proteinPcf11[Triboliumcastaneum]L4KY2850681295CG3199200.18PREDICTED:proteinGawkyisoformX6[Anoplophoraglabripennis]L5KY285071389CG537800.93PREDICTED:26Sproteasomenon-ATPaseregulatorysubunit6[Anoplophoraglabripennis]L6KY285072825CG1810200.76PREDICTED:dynamin-like[Anoplophoraglabripen-nis]L7KY285043508CG465900.95Predicted:signalrecognitionparticle54kDaprotein[Anoplophoraglabripennis]L8KY285050593CG1581100.91PREDICTED:proteinROPisoformX1[Anoplophoraglabripennis]L9KY285060409CG1691600.99PREDICTED:26Sproteaseregulatorysubunit6B[Ano-plophoraglabripennis]L10KY285076327CG659301PREDICTED:serine/threonine-proteinphosphataseal-pha-2isoform[Anoplophoraglabripennis]

2.2 喂食致死基因dsRNA對馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲取食量的影響

連續喂食一周表達L1～L12菌液后，馬鈴薯甲蟲幼蟲表現出拒食、發育遲緩的情況。在4個劑量50、5、0.5和0.05 μg的dsRNA處理中，在劑量50與5 μg處理葉片上的幼蟲取食率呈明顯下降趨勢，極顯著低于對照組、dsegfp處理組和低濃度處理組葉片上幼蟲的取食率。

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處理24 h時后，50 μg的各處理組葉片取食率與dsegfp處理組葉片上取食率差異不顯著(P>0.05)，取食率均在25%以下，危害等級為Ⅰ；0.05 μg 的處理組與對照組取食率差異不顯著(P>0.05)，但與其它處理濃度與dsegfp處理組的取食率有差異(P<0.05)。處理48 h后，各處理組取食率隨幼蟲生長均有上升，其中Ldalphasnap與LdSrp54k處理組較其他處理組取食率增長微效且緩慢，仍表現出最強的取食抑制，與對照組和dsegfp處理組存在極顯著差異(P<0.05)。其余各處理組在48 h時取食率大小依次為：LdGawky>Ldshi>Ldcact>LdRop>Ldinr-a>LdRpt3>LdRpn6>LdATPaseA>LdATPaseE。處理72和96 h后，Ldalphasnap、Ldcact、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3、LdATPaseA、LdATPaseE處理組幼蟲取食量隨天數增長呈明顯下降趨勢，濃度越高抑制反應越強，而在對照組和dsegfp處理組幼蟲取食率則呈繼續上升，接近甚至達到IV級的取食為害。圖1A-D

幼蟲在喂食表達dsRNA菌液后，于處理后第3 d出現顯著的的取食抑制表型，各處理組濃度加大，拒食率升高，即以處理后第3 d作為抑制取食表型的分析時刻。運用SPSS 20.0對幼蟲3 d的拒食率進行回歸分析。除LdRop處理組和拒食活性較低的Ldinr-a，其余各處理組中在dsRNA濃度為50 μg/mL與5 μg/mL是取食率均低于達12.5%，甚至不取食。其中LdSrp54k處理組拒食活性最高，拒食率回歸分析為：Y=2.711x-1.353，取食20%劑量為(1.39±0.13) μg。表3

圖1 喂食濃度梯度的dsRNA后第1～4 d(A-D)幼蟲取食的為害等級
Fig. 1 Larvae feed intake 1-4 days(A-D) after feeding dsRNA at gradient concentrations

表3 拒食活性統計分析與線性回歸方程
Table 3 Regression and D20analysis of 3-day after feeding dsRNA to 2nd instar CPB larvae

代號Symbol基因Gene拒食率回歸方程LinearregressingequationAD20AD20稀釋倍數DilutionmultipleL1Ldalpha-snapY=5.873x-3.0641.51±0.06 33.2±0.7L2LdcactY=4.523x-2.3021.57±0.09 31.9±2.8L3Ldinr-aY=9.892x-3.102228.13±6.72 0.2±0.1L4LdGawkyY=2.858x-1.371.61±0.0031±0.5L5LdRpn6Y=4.523x-2.3021.57±0.0331.9±0.3L6LdshiY=5.873x-3.0641.51±0.0133.2±0.7L7Ldsrp54kY=2.711x-1.3531.39±0.1335.9±3.0L8Ldrop---L9LdRpt3Y=7.403x-3.8351.78±0.0728±1.5L10LdpplaphaY=5.273x-2.4942.61±0.1519.2±0.9L11LdATPaseAY=3.46x-1.1875.29±0.279.5±3.2L12LdATPaseEY=4.076x-1.713.47±0.0614.4±0.8

注：AD20與稀釋倍數后的值為±SE

2.3 喂食致死基因dsRNA對馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲致死效果的評價

各處理組干擾后幼蟲減少取食甚至停止進食，迫使其生長發育得到抑制，最后導致死亡。 每日統計死亡頭數，待老熟幼蟲入土化蛹前，即dsRNA喂食處理第7 d后統計死亡率。各基因對馬鈴薯幼蟲在入土前均具有一定的毒殺作用，其中處理組LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、Ldalphasnap在dsRNA濃度為50 μg /mL下對馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲表現出高致死活性，致死率高達90%～93%。LdGawky、LdRop、Ldcact、LdRpn6、LdRpt3、LdATPaseA、LdATPaseE、Ldalphasnap、LdSrp54k處理組在dsRNA濃度為50 μg /mL與5 μg /mL下致死率均超過50%，致死活性隨濃度增高而增大，表現出劑量依賴效應。與對照組存在顯著差異(P< 0.05)。圖2

注：誤差線為±SE，誤差線上端不同字母表示處理組內顯著性水平不同

Note:Bars means ±SE, different letters depict different significant level

圖2 喂食馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲dsRNA菌液后第7 d的存活率
Fig. 2 7-day survival rate of 2nd instar larvae after treated with dsRNA-expressing bacterial solution

運用SPSS20.0對處理后7 d的死亡率進行顯著性分析與回歸分析。入土化蛹前時間大約為處理后的第7 d，各致死基因LD50具體數值。表4

表4 致死活性統計分析與線性回歸方程
Table 4 Linear regression equation for medium mortality of 2nd instar larvae ofLeptinotarsadecemlineata

代號Symbol基因Gene死亡率回歸方程Linearregressingequation致死中量LD50稀釋倍數DilutionmultipleL1Ldalpha-snapY=3.45x-1.5933.52±0.3614.2±0.7L2LdcactY=3.708x-2.0341.84±0.3027.1±3.0L3Ldinr-aY=4.491x-0.99961.07±10.170.8±0.1L4LdGawkyY=5.797x-2.865.42±0.529.2±1.6L5LdRpn6Y=4.087x-2.4621.18±0.1042.4±3.1L6LdshiY=5.174x-2.10812.59±0.484±0.7L7Ldsrp54kY=3.227x-1.8861.3±0.0638.3±1.8L8LdropY=4.164x-2.4111.48±0.0033.8±3.7L9LdRpt3Y=3.814x-2.0791.93±0.0725.9±3.4L10LdpplaphaY=6.195x-2.6216.63±0.733±0.5L11LdATPaseAY=4.308x-2.1833.08±0.2316.2±0.2L12LdATPaseEY=4.681x-2.2454.54±0.5411±0.3

2.4 喂食致死基因dsRNA對馬鈴薯甲蟲幼蟲化蛹率的影響

老熟幼蟲入土化蛹后第7 d統計化蛹率。結果表明,各基因對馬鈴薯幼蟲化蛹率均具有一定抑制作用，與對照組存在顯著差異(P<0.05)。且化蛹率隨處理濃度的增加而減小，其中處理組Ldalpha-snap、LdSrp54k、Ldcact、LdRpn6、LdSrp54k、LdATPaseA、LdATPaseE、在dsRNA濃度為50 μg /mL下對馬鈴薯甲蟲老熟幼蟲化蛹率低至0。Ldpp1alpha-96a、LdRpt3、Ldalphasnap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRop、LdGawky、Ldshi、Ldcact、處理組在dsRNA劑量為50 μg與5 μg下化蛹率均未超過50%。即使劑量低至0.05 μg，也能相比對照降低幼蟲20%～30%的化蛹率。圖3

注：誤差線為±SE，誤差線上端不同字母表示處理組內顯著性水平不同

Note:Bars means ±SE, different letters depict different significant level

圖3 喂食dsRNA菌液的馬鈴薯甲蟲幼蟲化蛹率
Fig. 3 Pupation rate of larvae of fed with dsRNA bacterial solution

運用SPSS21.0對老熟幼蟲入土化蛹率進行顯著性分析與回歸分析。入土時間大約為7 d，各致死基因PD50具體數值。表5

表5 處理dsRNA后幼蟲化蛹率的線性回歸方程
Table 5 Linear regression and PD50analysis for pupation rate

代號Symbol基因Gene化蛹率回歸方程Linearregressingequation化蛹中量PD50稀釋倍數DilutionmultipleL1Ldalpha-snapY=5.073x-3.4430.39±0.01128.4±5.7L2LdcactY=3.633x-2.2620.81±0.0861.5±0.0L3Ldinr-aY=6.064x-2.13231.20±1.891.6±0.3L4LdGawkyY=6.934x-5.3440.06±0.01788.5±61.9L5LdRpn6Y=5.581x-4.5180.07±0.00758.6±130.0L6LdshiY=4.779x-3.0290.67±0.0874.2±9.9L7Ldsrp54kY=2.708x-1.8050.65±0.1076.7±11.3L8LdropY=3.987x-2.3930.98±0.0851.0±4.2L9LdRpt3Y=3.697x-2.1191.24±0.2440.5±6.8L10LdpplaphaY=2.976x-1.7880.98±0.1951.0±4.3L11LdATPaseAY=3.551x-2.4280.50±0.09100.8±11.7L12LdATPaseEY=3.21x-2.2610.46±0.02109.8±15.9

2.5 備選基因dsRNA的致死效果的綜合分析和致死效應的關鍵指標

L1～L10基因與LdATPaseA、LdATPaseE的拒食活性、致死活性、 抑制化蛹活性對比分析。Ldalpha-snap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、LdGawky、Ldcact、Ldshi總計7個基因的dsRNA取食20%劑量顯著低于LdATPaseA與LdATPaseE；Ldcact、LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、Ldrop總計5個基因的dsRNA致死中量低于LdATPaseA與LdATPaseE；Ldalpha-snap、LdRpn6、Ldcact總計三個基因的dsRNA化蛹中濃度顯著低于LdATPaseA與LdATPaseE。在綜合比較對葉片減少為害的速效性和致死效率來看，Ldcact、LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、Ldrop五個基因在表現上優于LdATPaseA與LdATPaseE。表6

表6 備選致死基因拒食活性、致死活性、 抑制化蛹活性對比
Table 6 Comparison and analysis of repulsion, lethal and Chrysalis activities

代號Symbol基因名稱Genename取食20%劑量ID20致死中量LD50化蛹中量PC50L1Ldalpha-snap1.51±0.063.52±0.360.39±0.01L2Ldcact1.57±0.091.84±0.300.81±0.08L3Ldinr-a228.13±6.7261.07±10.1731.20±1.89L4LdGawky1.61±0.005.42±0.520.06±0.01L5LdRpn61.57±0.031.18±0.100.07±0.00L6Ldshi1.51±0.0112.59±0.480.67±0.08L7Ldsrp54k1.39±0.131.3±0.060.65±0.10L8Ldrop-1.48±0.000.98±0.08L9LdRpt31.78±0.071.93±0.071.24±0.24L10Ldpplapha2.61±0.1516.63±0.730.98±0.19L11LdATPaseA5.29±0.273.08±0.230.50±0.09L12LdATPaseE3.47±0.064.54±0.540.46±0.02

3 討 論

目前RNA干擾技術在基因功能方面的研究已經較為成熟[15]。然而，在RNA干擾技術應用于害蟲防治方面，還面臨著諸多問題[16-17]。例如所選取的RNA干擾的靶標基因，作用時間過于緩慢，往往需要7 d甚至更久才能使昆蟲出現拒食，蛻皮或不能正常化蛹等表型，作用方式類似于生長調節劑。因此,需要進一步對高效快速的致死基因進行挖掘。先前對LdATPase的研究，其致死中濃度為dsRNA表達菌液的0.001 2倍，處理LdATPase的幼蟲均會在處理后第2 d出現拒食表型，在較高濃度處理下的馬鈴薯甲蟲幼蟲行動力下降，全部不能入土化蛹，在中低濃度處理下馬鈴薯甲蟲能夠入土，但是在土中部分甚至全部不能正常化蛹[12]。實驗選定的赤擬谷盜致死效率最高的10個基因中的Ldalpha-snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3基因在馬鈴薯甲蟲上表現的致死效果高于LdATPaseA和LdATPaseE。

Tcpp1alpha-96a、TcRpt3、Tcalphasnap、TcSrp54k、TcRpn6、TcRop、TcGawky、Tcshi、Tccact、Tcinr-a以上10個基因在赤擬谷盜上注射8 d即可達到100%的死亡率[11]。而在研究中沒有在馬鈴薯甲蟲上表現出如此高的致死活性。考慮可能是以下幾個方面導致。一方面，dsRNA的遞送方式不同，Ulrich等對赤擬谷盜的研究[11]采用注射dsRNA的方法。其優點是dsRNA迅速精準到達組織，干擾效率相對高，但是在干擾過程中對幼蟲造成了機械損傷，該損傷是否對RNA干擾的效果造成協同的影響不可而知。而研究采用的喂食dsRNA的方法雖然操作容易、成本低、省時、對蟲體不會造成機械性損傷[18-20]，但是由于需要經過腸道消化吸收，基因沉默效率相比較于注射法會低。另一方面，物種差別也可能導致RNA干擾的差異，不同昆蟲由于血淋巴和腸道環境差異大導致dsRNA降解消化和攝取的效率差異也大。如煙草天蛾Manducasexta相比德國小蠊Blattellagermanica，血淋巴和腸道中具有更高活性的雙鏈核酸酶。而赤擬谷盜是雜食性的倉儲害蟲，而馬鈴薯甲蟲屬于專食性的食葉害蟲，雖然同屬于鞘翅目但是食性差別仍然較大。此外，dsRNA所用的劑量也有差異，Ulrich等對赤擬谷盜的研究[11]注射dsRNA劑量為3 ng/μL、30 ng/μL、300 ng/μL、1 μg/μL。研究通過飼喂法向馬鈴薯甲蟲喂食50 μg /mL、5 μg /mL以及0.5 μg /mL濃度劑量的dsRNA，攝取劑量不同差異也會較大。因此，未來應對原核表達dsRNA的系統，建立一套在蟲體、植株內和環境中的dsRNA的定量檢測技術，利于注射法、喂食法的平行比較。

此外，RNA干擾雖然作用過程緩慢，普遍要5～7 d才會導致幼蟲死亡[11,12]，但是研究對易獲得的表型指標進行了量化，包括葉片的取食量、7 d的致死率和化蛹率。發現在適當的劑量下，致死基因的dsRNA能夠在2～3 d即可導致幼蟲的取食量大幅下降，甚至絕食，在第7 d導致幼蟲的完全死亡，這足以達到田間防控的目的。因此,研究提出的AD20和7 d幼蟲的LD50，尤其是AD20是評價致死基因效果的關鍵指標。

4 結 論

通過RNA干擾從馬鈴薯甲蟲中篩選獲得了Ldcact、Ldalpha-snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3五個具有較高抑制取食活性和致死效果的基因。提出并推薦AD20和LD50是評價備選基因dsRNA對幼蟲致死效果的關鍵指標。